PCR Remming door DNA

[Dionisia]

HELLO ALLEN!

Ik heb een groot pcr probleem. Ik probeer om pcr te leiden gebruikend plasmideDNA ik het gebruiken van een uitrusting van Qiagen Midi zuiverde.

Ik gebruik deze DNA om een standaardkromme voor qRT-PCR te maken.

Mijn standaardkromme voor qRT-PCR bestaat uit een five-point periodieke verdunning die van 10ng tot 0.01ng van DNA in een 25uL reactievolume gaat.

Mijn probleem is dat ik geen versterking met de hoogste twee punten op de kromme zie die 10ng en 1ng vlekken is.

Ik denk niet mijn reagentia beperken omdat ik de PCR reactie bij hogere concentraties dan degenen op mijn kromme optimaliseerde. Iets remt mijn PCR versterking in de hogere concentraties van DNA en zelfs stelde een vertegenwoordiger Qiagen voor dat mijn DNA PCR kan remmen.
Heeft iedereen om het even welke ideeën?
dank voor everyoneshulp vooraf
cheers

[postdock]

Hey daar,

welke elution buffer gebruikte u, de buffer van Qiagen EB?

Er zijn zouten en EDTA in Qiagen EB die het PCR probleem kan veroorzaken.

Ook vergeet niet dat er overblijvende ethylalcohol van uw miniprep zou kunnen zijn die de efficiency van de PCR reactie kan remmen.