De sponsor/adverteert & Link met ons & Contacteer ons & Ongeveer ons & Help ons

Moleculaire Biologie Blog

De recente Posten van het Forum

 

De Spijsvertering van het Enzym van de beperking

De Enzymen van de beperking

©2006 moleculaire Post

Informatie over hoe te een deskundige te worden op de Enzymen en het verteren van van de Beperking DNA!

Achtergrond op de Enzymen van de Beperking

De enzymen van de beperking (of beperkingsendonucleases) zijn enzymen die double-stranded DNA door twee onderbrekingen, door elk van de fosfaatbackbones van de dubbele schroef te maken snijden. Het enzym doet dit zonder de basissen van DNA te beschadigen. Hoewel het enzym DNA breekt, kunnen de chemische banden door andere enzymen worden opnieuw gevormd die als ligases van DNA worden bekend. Daarom kunnen de beperkingsfragmenten van DNA van verschillende chromosomen of genen samen worden afgebonden, op voorwaarde dat hun einden complementair zijn.

Nut van de Enzymen van de Beperking in Moleculaire Biologie

Het feit dat DNA de gemanipuleerde en verschillende stukken van DNA zou kunnen zijn kon nu, opengestelde nieuwe onderzoeksgebieden nooit samen worden verbonden vóór ingebeeld. Veel van de methodes in moleculaire biologie baseren zich vandaag op beperkingsenzymen. De „beperking wordt“ afgeleid uit het feit dat deze enzymen initally in E. coli werden ontdekt dat scheen om de besmetting van specifieke bacteriofagen („virussen“ van bacteriën) te beperken. Het wordt geloofd de beperkingsenzymen een mechanisme van de gastheerdefensie dat door bacteriën en andere organismen wordt geëvolueerdp zijn zich tegen virale besmettingen te verzetten, en met de verwijdering van virale opeenvolgingen te helpen.

In 1978, werd de Prijs van Nobel voor Geneeskunde toegekend aan Werner Arber, Daniel Nathans en Hamilton Smith voor hun ontdekking van beperkingsendonucleases, die tot de ontwikkeling van de recombinante technologieën van DNA leiden. Het eerste praktische gebruik van beperkingsenzymen in wetenschap en geneeskunde was de manipulatie van de bacteriën van E. coli om recombinante menselijke insuline voor diabetici uit te drukken.

 

De behandeling van en het Gebruiken van de Enzymen van de Beperking

Een eenheid van de activiteit van het beperkingsenzym wordt door de hoeveelheid restritionenzym die wordt vereist bepaald om 1 microgram van bacteriofaaglambda DNA aan voltooiing in een tijd van 1 uur te snijden.

De analyses die door de fabrikant van de enzymen worden ontwikkeld worden het waarschijnlijkst gedaan gebruikend hoogst gezuiverde DNA (d.w.z. plasmiden of lambda phage DNA) als substraat, en analysevoorwaarden die de beste resultaten met hun bijzondere voorbereiding veroorzaken. Vaak zijn de laboratoriumvoorwaarden niet ideaal, en een lichte overmaat van enzym of een langere incubatieperiode wordt gebruikt helpen volledige spijsvertering verzekeren.

Er zijn vele „universele“ enzymbuffers die met een verscheidenheid van enzymen zullen werken, maar voldoen zij vaak niet aan de meest efficiënte eisen ten aanzien van elk enzym. Omdat de universele buffers niet efficiënt zijn, adviseren wij hun routinegebruik in het laboratorium niet (vooral voor complexe genomic DNAs; de samenvattingen van complexe genomic DNAs zijn gewoonlijk bij de hoge concentraties van DNA die het enzym zullen verbieden; ook, kan vrij ruwe DNA preps inhibitors bevatten wat langer meer de incubatietijden van het eenhedenenzym ard voor volledige spijsvertering vereist). Het is altijd best om de geadviseerde de analysevoorwaarden van de fabrikant voor restricitionspijsvertering te gebruiken. Sommige fabrikanten hebben enzymen gekloond die zeer verschillende vereisten van andere versies van het zelfde enzym hebben, zo controle alvorens te gebruiken. De concentraties van het enzym worden altijd gegeven aan de kant van de enzymbuis. De enzymen van de beperking die in het laboratorium worden worden gebruikt altijd opgeslagen bij -20 graden C (in een glycerolbasis), en zouden zoals bijna -20 graden C moeten worden gehouden mogelijk om het leven van het enzym uit te breiden. Wanneer de vestigingssamenvattingen, de reactiebuis aan de enzymdiepvriezer in een ijsemmer brengen; verwijder de enzymbuis uit de diepvriezer en houd de buis op ijs terwijl het werken met het enzym. Keer onmiddellijk de buis aan de diepvriezer terug wanneer gebeëindigd. Gebruik pipetmen slechts aangewezen voor beperkingsenzymen en altijd gebruiken een vers pipetman uiteinde wanneer het verwijderen van enzym uit de voorraadbuis.

 

Uiteinden op het Gebruik van het Enzym van de Beperking

• Al fabrikant van beperkingsenzymen voorziet specifieke buffers van de enzymen, en deze zouden in de diepvriezer moeten worden opgeslagen -20°C. De Enzymen van de beperking zouden ook bij -20°C. moeten worden opgeslagen.
• Maak nooit omhoog beperkingssamenvattingen met het beperkingsenzym dat meer dan 1/10 van het definitieve volume samenstelt. Dit is toe te schrijven aan het feit dat de proteïnen van het beperkingsenzym in glycerol worden opgeslagen. Bij concentraties boven 10%, remt de glycerol niet alleen de spijsvertering maar ook kan steractiviteit veroorzaken - leidend tot afwijkende, niet-specifieke besnoeiingen van DNA.
• Zet een controlesamenvatting op wanneer het gebruiken van beperkingsenzymen. Dit helpt u weten of behoorlijk werkt het enzym en u plaatst goed de reactie op. Gebruik een plasmideDNA die bekende fragmentatiepatronen produceert.
• Wanneer het voorbereiden van dubbele enzymsamenvattingen, bepaal het zoutgehalte van de buffers. Leid beperkingsspijsvertering gebruikend het enzym met de lagere zoute vereisten EERST, dan gebruik het tweede enzym door de buffer van de reactiebuis aan de tweede optimale zoute concentratie aan te passen.
• De voorbereidingen van DNA kunnen onzuiverheden hebben die de spijsverteringsactiviteit van het beperkingsenzym kunnen remmen. Sommige de isolatieuitrustingen van DNA gebruiken zelfs de hoge buffers van het EDTA om DNA uit te wassen. Dit is o.k. voor de opslag van DNA, maar de hoge concentraties van EDTA kunnen beperkingsspijsvertering remmen. PCR zuivert uw DNA en wast met TE of water uit als uw enzymactiviteit geremd is maar uw DNA kijkt o.k. U kon ook zien Mg2+ ook toevoegen aan de reactie en of die hulp.
• Als u volledige beperkingsspijsvertering van uw DNA niet kunt verkrijgen na het toevoegen van extra enzym, zet een nieuwe samenvatting op en voeg spermidine aan een definitieve concentratie van 2 mm toe.

De Spijsvertering van het Enzym van de beperking van DNA

 

De analytische tegenover Voorbereidende Spijsvertering van het Enzym van de Beperking

Gewoonlijk wordt de spijsvertering van DNA geleid in ul 25 - 50 (microliters), wanneer u enkel uw DNA controleren of wilt analyseren. Deze worden genoemd de analytische spijsvertering van het beperkingsenzym.

Men kan 0.25 tot 2 ug (microgrammen) voor analytische voorbereidingen verteren. Dit is omdat op agarose minigel (30ml), men .05ug (50 ng, nanograms) per band kan ongeveer visualiseren. De visualisatie van een band hangt van de lengte van DNA en de aanwezige hoeveelheid DNA af. In het algemeen, langer DNA huidig in de band, gemakkelijker zal zijn is te zien.

 

De spijsvertering van DNA van vele microgrammen en hogere volumes van ul 50 - 500 (microliters) of meer is voorbereidend, betekenend dat u de fragmenten van DNA voor het verdere reiniging en klonen voorbereidt.

 

De Spijsvertering van de beperking van het protocol van DNA

Recept voor de Spijsvertering van het Enzym van de Beperking:

Analytisch

10X de Buffer van het Enzym van de beperking Gebruik deze grafiek	ul 10
DNA (vele microgrammen van DNA)	Ul van DNA 20 of meer van „X“ ul
Water dH2O (millipore of gesteriliseerd met autoclaaf)	86 - X ul
Het Enzym van de beperking (U 10-20)	ul 4
Totaal	ul 100

 

U zou Mg2+ aan de spijsverteringsreactie (in de vorm van MgCl) kunnen toevoegen als u een groot volume van DNA gebruikt. U zou dit moeten doen vooral als de buffer u uw DNA in bevat EDTA uitwaste. Dit is omdat als „X“ groot is, d.w.z. > 20ul het volume, u kan Mg moeten toevoegen. Het EDTA bindt aan 4 mollen Mg voor elke mol van EDTA. Aldus, zal DNA in a1mm (milimolar) oplossing van EDTA 4mM van Mg binden. Een goede vuistregel moet 1 1ul van 10mM MgCl aan elke 20ul van DNA toevoegen.

 

Voorbereidend

10X de Buffer van het Enzym van de beperking Gebruik deze grafiek	ul 5
DNA	Ul 0.25 tot 10 van DNA van „X“ ul
Water dH2O (millipore of gesteriliseerd met autoclaaf)	43 - X ul
Het Enzym van de beperking (U 10-20)	1 ul
Totaal	ul 50

Broed bij 37°C uit 1 - 3 uren.

1 eenheid is genoeg enzym aan digest1ug DNA op zijn minst in 1 uur. Het verteren 3 uren u kon hogere hoeveelheden DNA verteren. Aangezien u 10-20 Eenheden van enzym toevoegt, kon u 10ug van DNA in 1 uur zelfs verteren! De enzymen zijn duur overbodig verspillen hen niet!

Nota's over het Gebruik van het Enzym:

• Houd enzymenkoude.
• Houd altijd beperkingsenzymen op ijs!
• Minimaliseer de tijd u beperkingsenzymen op ijs hebt. U kunt dit gemakkelijk doen door een koude doos (die fundamenteel een blok van metaal is u binnen uw enzymen houdt) te kopen

 

Verwijzingen:

Sambrook, J., Fritsch, E.F., en T. Maniatis. (1989) het Moleculaire Klonen, een Handboek van het Laboratorium. Tweede uitgave. De koude Pers van het Laboratorium van de Haven van de Lente. pp 5.3 - 5.32.

Als dit protocol nuttig was, gelieve te verbinden met ons!

©2006 moleculaire Post