De sponsor/adverteert & Link met ons & Contacteer ons & Ongeveer ons & Help ons

Moleculaire Biologie Blog

De recente Posten van het Forum

 

Het Protocol van de Isolatie van DNA van Genomic

Het selecteren van een Methode van de Reiniging van DNA Genomic

Het doel van de genomic isolatie van DNA hangt af van wat de toepassingen van DNA na isolatie. De zuiverheid, de bron, de hoeveelheid en de kwaliteit DNA zijn alle kwesties die voorafgaand aan de genomic extractie van DNA moeten worden behandeld. Een massa verschillende methodes, technologieën en uitrustingen zijn beschikbaar nu aan onderzoekers om genomic DNA van cellen te isoleren.

• Nodig hoeveelheid DNA
• Moleculegewicht en grootte van DNA
• Vereiste zuiverheid van DNA
• Stroomafwaartse toepassingen van DNA
• Beschikbare tijd
• Gemak van de extractietechniek of methode van DNA
• Beschikbare uitgave of geld

De extractiemethodes van inlandse of laboratorium specifieke DNA vaak vrij goed voor laboratoria die hen hebben ontwikkeld en regelmatig deze protocollen gebruikt.

Nota nochtans deze normalisatie van het methodesgebrek. Ook zijn de opbrengst van DNA en de kwaliteit van DNA niet altijd reproduceerbaar van één persoon aan volgende.

Achtergrond op de Isolatie en de Reiniging van DNA Genomic

Over het algemeen, houden alle methodes de verstoring en lysis van cellen in. Dit wordt gevolgd soms door de verwijdering van RNA (door RNAses, zout of andere methodes). Kiezend welke methode aan gebruik zal afhangen van vele selectiefactoren met inbegrip van:

DNA wordt geïsoleerd van proteïnen door verscheidene methodes met inbegrip van spijsvertering van proteïnen door de enzymproteïnase K. Proteins wordt verwijderd later door zouten, organische extractie of, van DNA aan een solid-phase steun (zoals een anion-exchange kolom of kiezelzuurtechnologie) te binden.

DNA wordt definitief teruggekregen door ethylalcoholprecipitatie of isopropanol precipitatie.

In het algemeen, kan de scheiding van DNA van cellen en cellulaire componenten in vier stadia worden verdeeld:

1. De verstoring van de cel
2. Lysis van Cel
3. Verwijdering van Proteïnen en Verontreinigende stoffen
4. Terugwinning van DNA

In sommige genomic de isolatieprotocollen van DNA, worden stadia 1 en 2 gecombineerd.

Materialen Nodig voor de Methode van de Extractie van DNA Genomic

Lysis Buffer voor het Recept van DNA Genomic:

50 mm tris-HCl, pH 8.0
50mM EDTA
1% SDS
10mM NaCl

De Methode van de Reiniging van DNA van Genomic van de Steekproeven van het Weefsel

1. Selecteer weefselsteekproef aan gebruik. Zorg ervoor de steekproef behoorlijk wordt voorbereid en op ijs gehouden. Als de steekproef niet onmiddellijk voor de extractie van DNA zal gebruikt worden, dan moeten de steekproeven behoorlijk in of diepvriezer -20°C voor langere termijn worden opgeslagen of 4°C voor (weinig uren) gebruik op korte termijn.
2. Het weefsel van de besnoeiing in kleinere stukken. Voor lever of ander zacht weefsel, me maak niet over het maken van fijne stukken ongerust.
3. Voeg weefsel aan een pre-cooled (droog ijs) mortier toe, voeg onmiddellijk vloeibare stikstofN2 toe.
4. Begin weefsel in fijn poeder te malen. Voeg meer Liq toe. N2 zoals nodig. Opende het koude poeder van de overdracht aan 30 mlbuis, verlof zodat kan N2 verdampen.
5. Voeg 9 ml van per-verwarmde (5°C) Lysis buffer toe en stel zacht poeder opnieuw uit.
6. Voeg ul 100 van 10mg/ml van Proteïnase K, (d.w.z., 100 ug in oplossing) toe. Broed 55°C uit 1-18 uren. Mengeling zacht periodiek. Voeg ul 100 van Proteïnase K na eerste 2 uren toe, Optimum: 3 uren die Proteïnase K toevoegen om 1.5 uur.
7. Behandel zeer zacht steekproef. Voeg 1 ml van 3M Na0Ac (pH 4.0), 10 ml van warm (55°C) fenol, mengeling zacht maar grondig 5-10 minuten toe.
8. Centrifugeer steekproeven 15 minuten.
9. Herhaal warme fenolextractie.
10. Uittreksel met gelijk volume (10ml) fenol: De CIA (1 deelfenol: de 1 deelCIA: CIA= 23 delen chloroform: 1 deel isoamyl alcohol)
11. Uittreksel met extractie de gelijke van de volume (10ml) CIA
12. De hogere fase zou vrij duidelijk moeten zijn, als het grote witte invloeden bevat, of zeer melkachtig is, opnieuw broedt (i) bij 68°C - 15 min., en re-fenoluittreksel uit, (ii) begin, maar broedt langer met P-K uit.
13. De hogere fase van de overdracht aan nieuwe buis. Voeg zacht 2 volumes van koude ethylalcohol en mengeling toe (Zout: Na0Ac is reeds in oplossing). Gebruikend een haak en een verzegelde pasteur pipet uit spoelDNA. Veeg van bovenmatige ethylalcohol aan de kant van de buizen af. Stel in 2-5 mls van TE opnieuw uit. Zorg ervoor DNA volledig wordt opgelost (verlof op zachte schudbeker.)
14. Voeg de mengeling van RN-ase toe (100 ug van RN-ase A, 10U van RNaseT1). Broed 30 min 37°C. ** u uit RN-ase toevoegen vóór de proteïnase K, bij 37°C 1 uur kon uitbroeden en dan proteïnasespijsvertering beginnen. U kon stap 15- dan overslaan.
15. Voeg 100 ug van Proteïnase K, incubae 37°C 30 toe minuten.
16. Voeg 1/10 volume 3M Na0Ac, het uittreksel van het Fenol eens toe, Fenol: CIA- uittreksel tweemaal, CIA- uittreksel eens.
17. Voeg 2.5 volumes van EtOH toe, gezet in -20°C centrifugeren 30 min. 20 min.
18. De was goed met 70%, verwijdert al EtOH. Als u droogt, niet over DROOG.
19. Stel zorgvuldig opnieuw uit, langzaam in1-2mls TE (tris-EDTA buffer). (1x of 0.1x).

 

 

 

Andere Protocollen en Methodes van DNA

Het Klonen van DNA Gids

De Elektroforese van het Gel van DNA

De Spijsvertering van het Enzym van de beperking - allen u moet het weten!

Het Protocol van de Isolatie van DNA van Genomic

De Isolatie van DNA van Baceteria

De Transformatie van DNA - bevat Geschiedenis van DNA

Vind andere protocollen bij onze externe het middelfolder van de Protocollen van DNA of zie onze protocollen van DNA.

Verwant:

De Protocollen van DNA Microarray

PCR Protocollen

 

De Bio-informatica van DNA

De Bio-informatica van DNA van het bezoek.

 

DNA-verwant Nieuws

Het Nieuws van DNA