Het analyseren de EiwitInteractie van DNA

Leer over hoe te om DNA-Eiwitinteractie te analyseren.

Het analyseren Interactie DNAProtein

Er zijn vier belangrijke technieken voor het analyseren DNA-Eiwitinteractie. De eerste twee technieken (de Verschuiving van de Mobiliteit van de Band en van het Gel van de Filter) bepalen als uw DNA met proteïne in wisselwerking staat. De andere twee technieken (DNase Voetafdrukken en DMS Voetafdrukken) wijzen erop waar de doelplaats van interactie tussen proteïne en DNA op DNA ligt.

De Band van de filter

De het membraanfilters worden van het nitrocellulose algemeen gebruikt filter-sterilize oplossingen. De filters van het nitrocellulose kunnen DNA, maar slechts in bepaalde omstandigheden binden. Singlestranded DNA bindt gemakkelijk aan nitrocellulose, maar dubbel vastgelopen DNA alleen niet. Enerzijds bindt de proteïne, en als een proteïne aan double-stranded DNA verbindend is complexe eiwit-DNA zal binden. Gelieve te verwijzen naar artikel van de Analyse van de Filter van het Nitrocellulose het Bindende voor meer informatie.

Gelatineer de Verschuiving van de Mobiliteit

om DNA-Eiwitinteractie te meten baseert deze techniek zich op het eenvoudige feit dat een kleine DNA een veel hogere mobiliteit in gelelektroforese heeft dan zelfde DNA doet wanneer het aan een proteïne wordt gebonden. Wij daarom kunnen een fragment van soortdubbel vastgelopen DNA etiketteren, dan mengeling het met een proteïne, en electrophorese het complex. Dan onderwerpen wij het gel in autoradiografie om de geëtiketteerdek soorten te ontdekken. De kleine grootte van DNA is belangrijk in deze analyse. Als een geheel gen werd gebruikt zou zijn mobiliteit reeds zeer laag zijn, en de mobiliteitsverschuiving die door eiwitband wordt veroorzaakt zou moeilijk zijn te ontdekken. Daarom moeten wij ongeveer weten waar de proteïne aan DNA bindt zodat kunnen wij een kort beperkingsfragment, of zelfs synthetische double-stranded oligonucleotide voorbereiden dat de doelplaats voor de proteïne, maar weinig anders zullen bevatten.

DNase Voetafdrukken

Zodra wij weten dat een proteïne aan een bepaalde DNA bindt kunnen wij voetafdrukken gebruiken om te weten te komen waar de doelplaats op DNA ligt. Dnase de voetafdrukken baseren zich op het feit dat een proteïne, door aan DNA te binden, de bandplaats behandelt en zo het tegen aanval door Dnase beschermt. In deze betekenis verlaat het een „voetafdruk“ op DNA. De eerste stap in een voetafdrukkenexperiment is eind-etiket DNA. Wij kunnen één van beide etiketteren vastlopen, maar slechts per experiment. Daarna, binden wij de proteïne aan DNA. Dan behandelen wij het DNA-Eiwitcomplex met Dnase I in de milde omstandigheden (zeer weinig Dnase), zodat een gesneden gemiddelde van slechts één per de molecule van DNA voorkomt. Daarna, verwijderen wij de proteïne uit DNA, scheiden de bundels van DNA, en electrophorese gelatineren de resulterende fragmenten op een hoge resolutiepolyacylamide naast groottetellers. De fragmenten zullen van het andere eind van DNA eveneens het gevolg zijn, maar wij zullen hen niet ontdekken omdat zij zonder etiket zijn. Wij omvatten altijd een controle met alleen DNA (geen proteïne), en gebruiken gewoonlijk meer dan één eiwitconcentratie zodat kunnen wij zien door de geleidelijke verdwijning van de banden in het voetafdrukgebied dat de bescherming van DNA van de concentratie van de toegevoegde proteïne afhangt. De voetafdruk vertegenwoordigt het gebied van DNA dat door de proteïne wordt beschermd, en vertelt ons daarom waar de proteïne bindt.

DMS Voetafdrukken

Dnase de voetafdrukken geven een goed idee van de plaats van de bandplaats voor de proteïne, maar Dnase is een macromolecule en is daarom een eerder bot instrument voor het sonderen van de fijne details van de bandplaats. Welke middelen, dat er hiaten in de interactie tussen proteïne en DNA kunnen zijn Dnase niet waarin zou passen en daarom niet zou ontdekken. Voorts verstoren de bindende proteïnen van DNA vaak DNA binnen het bindende gebied, vervormend de dubbele schroef. Deze storingen zijn interessant, maar niet over het algemeen door Dnase voetafdrukken ontdekt omdat de proteïne Dnase weg houdt. Om meer gedetailleerde voetafdrukken te doen, hebben wij een kleinere molecule nodig die in de hoekjes en de spleten van DNA-Eiwit complex kan passen en meer van de subtiliteit van de interactie openbaren. Een favoriet hulpmiddel voor deze baan is de méthylerende agent dimethylsulfate (DMS).

Met DMS voetafdrukken die wij op dezelfde manier als in Dnase voetafdrukken, door DNA eind-te etiketteren en de proteïne zijn vertrokken te binden. Dan méthyleren wij het DNA-Eiwitcomplex met DMS, gebruikend een milde behandeling zodat gemiddeld slechts één methylation zelfs per de molecule van DNA voorkomt. Daarna, verjagen wij de proteïne, en behandelen DNA met een reagens die geméthyleerde purine verwijdert, creërend apurinic plaatsen (deoxyriboses zonder basissen) op DNA. Dan breken wij DNA bij deze apurinic plaatsen. Deze reacties zijn het zelfde als DNA maxam-Gilbert rangschikkend reacties. Tot slot electrophorese versplinteren wij DNA en autoradiograph het gel om de geëtiketteerdel banden van DNA te ontdekken. Elke band beëindigt naast een nucleotide dat en zo onbeschermd door de proteïne werd geméthyleerd.

Zie de Molecule van DNA in 3-afmetingen

deoxyribonucleic zuur