De sponsor/adverteert & Link met ons & Contacteer ons & Ongeveer ons & Help ons

Moleculaire Biologie Blog

De recente Posten van het Forum

 

De Voetafdrukken van DNA

De Moleculaire Post van het auteursrecht 2007

Achtergrond op de Voetafdrukken van DNA

DNase de voetafdrukken zijn een moleculaire biologiemethode die de opsporing van DNA-Eiwitinteractie door het bezit toelaat te exploiteren dat een proteïne die met DNA in wisselwerking staat DNA bij die interactieplaats tegen beperkingsspijsvertering of DNAase enzymatisch splijten zal beschermen. Een de beperkingsfragment wordt van DNA dat de specifieke bandplaats bevat aan de ene kant geëtiketteerdD, gewoonlijk met 32P en voor voetafdrukken gebruikt.

De proteïne en DNA worden toegestaan om te kruisen en samen te binden.

De voetafdrukken van DNA gebruiken enzymDNase I of deoxyribonucleic zure nuclease I te verteren of opengewerkte vrije radiolabeled (of geëtiketteerdt) DNA verlatend proteïne verbindende DNA beschermd. De de beperkingsfragmenten worden van DNA behandeld licht met DNase I, die single-strand onderbrekingen (inkepingen) in DNA maakt. Een kleine hoeveelheid enzym wordt gebruikt dusdanig dat er een gemiddelde van minder dan 1 inkeping/bundel is. De reactie wordt dan tegengehouden, wordt DNA gedenatureerd, en het mengsel wordt in werking gesteld op een het denatureren polyacrylamide rangschikkend gel. Deze fragmenten die door gelelektroforese worden gescheiden worden blootgesteld om het beschermde gebied van DNA te ontdekken door het het verbinden splijtenpatroon op het gel te analyseren.

Het splijtenpatroon van DNA bij gebrek aan een bindende proteïne van DNA, dat typisch als vrije DNA wordt bedoeld, wordt vergeleken bij het splijtenpatroon van DNA in aanwezigheid van een bindende proteïne van DNA. Als de proteïne DNA bindt, is de bandplaats beschermd tegen enzymatisch splijten. Deze bescherming zal in een duidelijk gebied op het gel resulteren dat als „voetafdruk“ wordt bedoeld.

Door de concentratie van de DNA-Bindende proteïne te variëren, kan de bindende affiniteit van de proteïne volgens de minimumconcentratie van proteïne worden geschat waarbij een voetafdruk wordt waargenomen.

 

DNAse de Recepten van de Buffer van Voetafdrukken

DNase Recept van de Buffer van Voetafdrukken het Bindende

2X w/oKCl/voor 10mls:

bedrag: [def.]
Tris-HCl pH7.6: ul 500 van 1M: 50 mm
MgCl2: 125ul van 1M: 12.5mM
EDTA: ul 2 van 0.5M: 1mM
Glycerol: 2 mls: 20%
DTT: ul 10 van 1M: 1 mm

Bindende Buffer (de buffer van de Verschuiving van het Gel)

5X w/oKCL
[def.]: ingrediënt
20%: gylerol
5mM: MgCl2
2.5mM: EDTA
2.5mM: DTT
250mM: NaCl
50mM: Tris-HCL, pH 7.5
0.25mg/ml: poly (Di-gelijkstroom) poly (Di-gelijkstroom)

Ca/Mg Buffer

Voor 10mls
CaCl2: ul 50 van 1M: 5 mm
MgCl2: ul 100 van 1M: 10 mm

De Oplossing van de lading
0.1 M: NaOH: formamid (1: 2 v/v)
0.1%: xyleen cyanol
0.1%: bromophenol blauw

De Buffer van het einde
10mls
NaCl: ul 400 van 5M: 200 mm
EDTA: ul 600 van 0.5M: 30 mm
SDS: 1 ml 10%:1%

TEBe (tris-EDTA-Bèta mercap.)
Tris-HCl, pH 7.6:500 ul van 1 M: 50 mm
EDTA: 2ul van 0.5 M: 1 mm
Bèta-mercaptoethanol: ul 10: 15mM

10 x K buffer
voor 1 ml
Tris-HCl pH 7.5:100 ul van 1 M: 100 mm
MgCl2: ul 100 van 1 M: 100mM
DTT: ul 50 van 1M: 50 mm
dH2O: ul 750

DNAse het Protocol van Voetafdrukken

Gewoonlijk gebruikte DNA bevat de bandplaats van uw proteïne van belang. DNA wordt gezuiverd, dan met beperkingsfragmenten om van een appopriategrootte verteerd te zijn. Het fragment van DNA wordt geëtiketteerdr op één eind (bandplaats > 25 bp van eind).

Één bundel etikettering kan zijn accomplised door:

1. isolerend het fragment met beperkingsenzym dat ' bevat overhangend gedeelte 5, etiketterend met Klenow en het aangewezen hete nucleotide. Dan samenvatting met een enzym dat één eind verwijdert.
2. het isoleren van een fragment dat met een beperkingsenzym dat wordt tot eind verteerd leidt 5 die ' en 3 ' zal, met Klenow etiketteert ' overhangend gedeelte slechts 5 etiketteren.
3. Zoals in „a“ maar met om het even welk enzym en het gebruiken van polynucleotidekinase om ' te etiketteren eind 3 (kinase) en het verteren van één van de einden met een tweede (derde) beperkingsenzym.
   (HERINNERING: als etikettering met Klenow, aan het eind van reactie voeg een overmaat van koud nucleotide van het zelfde nucleotide toe dat (d.w.z. als u dCTP32 gebruikt, voeg dCTP aan het eind toe) wordt geëtiketteerdi om alle einden ervoor te zorgen eveneens wordt ingevuld.

Voor fragmenten Klenow, brengen 0.3ug ul tot 100 in TE, hittedoden Klenow bij 68 °C 10 minuten.

ETIKETTERING met ' overhangend gedeelte één 5

Steekproef RXN: 15 ng is behoefte aan elke reactie. Als ENKEL het maken van sonde voor vele reacties hoeveelheid DNA tot 300 ngs verhogen.
15ng: Het fragment van DNA
ul 2: 10x de buffer van K
ul 5: 32P dCTP 3.33 uM 10 uCi/ul
ul 2: 2mM @ DA, DG dTTP
1 ul: Klenow
20 ul Definitief volume, 37°C 30 min.
--voeg 1 ul 10mM dNTP toe, 5 min @ 37°C.

--voeg 80 ul TE toe. 68°C 15 minuten, gezet op ijs.
--G-50 de Kolom van de rotatie (rotatie bij ongeveer 2000g)
--VOEG 1/10 volume 3M Na0Ac, 2.5 volumes EtOH, Ijs 30 toe Facultatieve mins, (als [DNA] = of > 3 ng/ul is u g-50 direct zou kunnen posten) Microfuge 30 minuten.
--was met 70%
--Droog breng omhoog in 5ul

Bindende Reactie voor DNase Voetafdrukken

De bindende Reactie zou tussen 10 en KCl 150mM (meer zout vermindert het binden maar verhoogt specificiteit) moeten hebben. De typische concentratie is 50mM.

De eiwit Band van DNA:
ul 25 van 2X Bindende KCl van de Buffer w/o
5ul van 3 ng/ul unilabeled DNA
X ul van KCl om 10-150 te evenaren mm- KCl
dH20 aan gelijke 50 protien ul minus volume voor band
1-3 de Eenheden van voetafdrukken van de bindende proteïne van DNA (of 10 tot 160 ug van Ruw kernuittreksel)

--mengeling zacht, ijs 10 minuten.

HOUD TIMING IN MENING,
--VOEG ul 50 van de oplossing van rechts Ca/Mg, 18°C 1 minuut toe.
--_ TOE:VOEGEN 3 ul verdund RQ1 DNase (0.05 u/ul ver*dunnen in Tris) UIT:BROEDEN 1 notulen.
--HOUD toevoeging van 90 met de oplossingen van het EINDE tegen 37°C,

--u zou Fenol moeten: De CIA -, en CIA- uittreksel, en het precipitaat van de Ethylalcohol.
--STEL opnieuw uit in 4ul van de Oplossing van de Lading.
--Looppas op 5% standaard ureum-DNA die gel (overweeg wiggel) rangschikt met de stegen van de appopriatelading zoals de ladder van DNA, ongesneden DNA, en controles.

Analyseer voetafdrukkenpatroon.

Het oplossen van problemen en Problemen? Zie het DNAse Forum van Voetafdrukken!

Voor problemen en het oplossen van problemenDNAase voetafdrukken, post een nieuwe draad om het in het Forum van de Voetafdrukken van DNA te bespreken!

Andere Protocollen en Methodes van DNA

Het Klonen van DNA Gids

De Elektroforese van het Gel van DNA

De Spijsvertering van het Enzym van de beperking - allen u moet het weten!

Het Protocol van de Isolatie van DNA van Genomic

De Isolatie van DNA van Baceteria

De Transformatie van DNA - bevat Geschiedenis van DNA

Vind andere protocollen bij onze externe het middelfolder van de Protocollen van DNA of zie onze protocollen van DNA.

Verwant:

De Protocollen van DNA Microarray

PCR Protocollen

 

De Bio-informatica van DNA

De Bio-informatica van DNA van het bezoek.

 

DNA-verwant Nieuws

Het Nieuws van DNA