Bio-informatica, Protocollen, RNA EiwitProteomics van DNA

huis > DNA > cdna-klonend > index.php

cDNA Klonend

Leer over cDNA het klonen.

cDNA Klonend

Een cDNA (plotseling voor complemantary DNA of exemplaarDNA) is een DNA- exemplaar van RNA, gewoonlijk mRNA. Soms willen wij een cDNAbibliotheek, een reeks klonen maken die zo velen op een gegeven moment reprensenting mogelijk van mRNAs in een bepaald celtype. Dergelijke bibliotheken kunnen tientallen duizenden verschillende klonen bevatten. Andere tijden, willen wij één bijzondere aclone maken cDNA- bevattend een DNA- exemplaar van enkel één mRNA. Deze techniek die wij hangt voor een deel gebruikt af hebben waarop van deze doelstellingen die wij hebben gewenst om te bereiken.

cDNA Bibliotheken

Als wij een cDNAbibliotheek willen bouwen, kunnen wij een eenvoudige maar efficiënte strategie gebruiken die zich op een proces genoemd inkepingsvertaling baseert. De essentie van inkepingsvertaling is de gelijktijdige verwijdering van DNA voor een inkeping (een single-stranded onderbreking van DNA) en synthese van DNA achter de inkeping. Het netto resultaat moet, de inkeping in richting bewegen of vertalen 5 ' - 3 '. Het enzym wij gewoonlijk de inkepingsvertaling gebruiken is polymerase I van DNA E.coli, die een 5 ' - 3 ' exonucleaseactiviteit heeft die het enzym toestaat om DNA voor de inkeping te degraderen aangezien het zich beweegt.

Het centrale deel om het even welke cDNA het klonen procedure is synthese van cDNA van een mRNA malplaatje dat omgekeerde transcriptase gebruikt. Omgekeerde transcriptase is als een ander DNA-Samenstelt enzym is dat het de synthese van DNA zonder een inleiding niet kan in werking stellen. Om rond dit probleem te krijgen, halen voordeel wij uit de polystaart (van A) bij 3 ' - eind van meeste eukaryotic mRNAs en het gebruik oligo (dT) als inleiding. Oligo (dT) is complementair tot poly (A), zodat bindt het aan poly (A) bij 3 ' - eind van mRNA en maakt de synthese van DNA klaar, gebruikend mRNA als malplaatje.

Nadat mRNA is gekopiÃërd, opbrengend een single-stranded DNA (de „eerste bundel“), degraderen wij gedeeltelijk mRNA met ribonuclease H (RN-ase H). Dit enzym degradeert de bundel van RNA van een hybride RNA/DNA enkel wat wij moeten beginnen RNA van onze eerste bundel te verteren cDNA. De resterende fragmenten van RNA dienen als inleidingen voor het maken van de „tweede bundel,“ gebruikend eerste als malplaatje. Dit is de inkeping-vertaling fase van het proces en opnieuw, is polymerase I van DNA van E. coli het enzym dat wij hebben gebruikt om de inkeping-vertaling reactie uit te voeren. Het netto resultaat bedraagt een double-stranded cDNA met een klein fragment van RNA 5 ' - eind van de tweede bundel.
Onze volgende taak is cDNA aan een vector af te binden. Dit was gemakkelijk met onze stukken van genomic DNA die met beperkingsenzymen wordt gespleten, maar cDNAs hebben geen kleverige einden. Wij kunnen botte einden afbinden samen, alhoewel dat een vrij inefficiënt proces is. Nochtans, als wij de efficiënte afbinding willen die tegen kleverige einden wordt veroorloofd, kunnen wij kleverige oligo einden ([gelijkstroom]) op cDNA vastspijkeren, gebruikend een enzym genoemd einddeoxynucleotidyltransferase (TdT) of eenvoudig eindtransferase en één van de deoxribonucleosidetrifosfaat. In het geval, gebruiken wij dCTP. Het enzym voegt dCMPs, tegelijkertijd, aan 3 toe ' - einden van cDNA. Op de zelfde manier, maken wij oligo (DG) einden aan onze vector vast en staan oligo (gelijkstroom) s toe om aan oligo (DG) s. te ontharden. Dit brengt de vector en cDNA in een recombinante DNA bijeen die direct voor transformatie kan worden gebruikt. Basis in paren rangschikken tussen de oligonucleotide staarten is sterk genoeg dat geen afbinding vóór transformatie wordt vereist. Ligase van DNA binnen de omgezette cellen voert definitief de afbinding uit.

Zie de Molecule van DNA in 3-afmetingen