Het Klonen van DNA

Het klonen Tussenvoegsels in Plasmiden

Het Klonen van DNA Protocol

Om te klonen hebt u het volgende nodig:

Vector DNA of uw plasmideconcept

Vector DNA kan zijn:
Vector of DNA van de Plasmide (die moet zijn

Om te klonen hebt u minstens verscheidene microgrammen (3-5 of meer) van uw vectorDNA nodig.

DNA van het tussenvoegsel (DNA die u hebt willen om in de plasmide of de vector opnemen)

DNA van het tussenvoegsel kan zijn:
Oligonucleotide Tussenvoegsel (oligos met de helft-plaatsen van de beperkingsbesnoeiing die en phosphorylated met PNK worden onthard)
Enzym van de beperking produceerde Tussenvoegsel
PCR Tussenvoegsel (PCR met beperkingsenzym sneed plaatsen (de gehele plaats is nodig!) in' eind 5 van de inleiding)

Als het Tussenvoegsel u wilt klonen minder dan 60 bp is, kunt u tot oligonucleotides opdracht geven en hen samen ontharden.

Als uw grootte van tussenvoegselDNA (minder dan 1000 bp) klein is, hebt u theoretisch zo veel DNA niet nodig zoals uw vector. Als uw grootte van tussenvoegselDNA (10-200 bp) uiterst klein is, hebt u zeer weinig theoretisch van deze DNA nodig.

In het algemeen zou u minstens 1 microgram van beginnende tussenvoegselDNA moeten hebben.

Het voorbereiden van VectorDNA voor het Klonen: Mini-prep, Midi-Prep, maxi-Prep

Wij vonden dat de gemakkelijkste manier om DNA voor te bereiden een mini-prep uitrusting (Qiagen) gebruikt. Wij gebruiken verscheidene kolommen voor het zelfde vectorconcept van DNA. 

Voor elke kolom voegen wij ongeveer 4 ml pond gekweekte bacteriën (wij voegen 2 ml de bacteriënbouillon van pond aan een 2 ml eppendorf buis en rotatie tweemaal toe = 2 X 2 ml = 4 ml) toe

Uiteinde: Kweek altijd ongeveer 5 ml van pond in de Buizen van de 15 mlValk, houden 1 ml als voorraad van glycerolbacteriën die in wordt bevroren - de diepvriezer van 80 C.

Hoe te om tot een Glycerol Bacteriële Voorraad voor te maken - de Diepvriezer van 80 C die jarenlang zal houden (u zult nooit platen moeten wegschieten of bekwame cellen opnieuw maken! - bespaart u tijd)

Voeg 50% eenvoudig glycerol aan uw bacteriële groei pond toe. Dit moet niet nauwkeurig zijn d.w.z. als u met ongeveer 1 ml van bacterieel pond toevoegt uL ongeveer 500 van 100% glycerol en vorst in - 80 C. wordt verlaten.

Na het uitwassen van elke kolom met uL ongeveer 50 van EB (elution buffer, Qiagen, buffer Tris - Bevat geen EDTA), voegen wij eluates samen dusdanig dat wij uL rond 200 aan uL hebben 400 (of 4 - 8 kolommen per concept of vector). Dit is geeft genoeg beginnende vectorDNA voor het klonen.

Nota: wij vonden dat het EDTA in TE verdere beperkingsspijsvertering van uitgewassen DNA van de mini-prep en andere uitrustingen van de plasmidereiniging remt.

Het voorbereiden van DNA van het Tussenvoegsel voor het Klonen

DNA van het tussenvoegsel moet zijn

De Spijsvertering en het Knipsel van het Enzym van de beperking Uw Vector van de Plasmide voor het Klonen van DNA

De vector van de plasmide wordt gewoonlijk gesneden.

Afbinding van Tussenvoegsel en Vector

Om tussenvoegsel aan Vector af te binden, gebruik 200 ng van Vector als gids (mensengebruik zo weinig zoals 50 ng - N.e.b- handboek).

Neem ng op      =       Vector ng               
De grootte van het tussenvoegsel            Vector grootte

Daarom een 500 bp tussenvoegsel in een 5000 bp vector moeten afbinden zou u

Tussenvoegsel ng      =       200 ng X   500                         
                             5000

Tussenvoegsel ng      =      20 ng van tussenvoegsel nodig voor a1: 1 afbinding

Voor een tussenvoegsel 3:  1 vectorafbinding die u zou vereisen: 60 ng

Afbinding

X uL    DNA vector 200 ng
Y uL     Tussenvoegsel (berekende ng)
2 uL 10 de Buffer van X
1 Ligase van uLT4 DNA NEB
 aan uL 20     H20

uL 20   Totaal

Neem uL 5 van Afbinding en voeg aan uL 100 van DH 5 alpha- cellen Invitrogen toe
(Subcloning o.k. efficiency, beter Ontsproten Één, het Maximum beste van de Efficiency - voor harde afbindingen maar duur).

Verwarm Schok
Voeg uL 250 van Soc aan bekwame Cellen toe

Plateer VOLLEDIG bedrag op plaat.

Groei overnite bij 37 C