Mycoplasma Verontreiniging & De Cultuur van de cel

Mycoplasmas is een soort bacteriën die een celwand niet hebben. wegens een gebrek aan een celwand, zijn zij bestand tegen vele antibiotica met inbegrip van penicilline of andere bèta-lactamantibiotica die celwandsynthese richten.

Mycoplasma is of parasitisch of saprofytisch. Verscheidene Mycoplasma ziekte-veroorzaakt in mensen, met inbegrip van pneumoniae van M., wat een belangrijke oorzaak van atypische longontsteking en andere ademhalingswanorde is, en genitalium van M., die om in bekken ontstekingsziekten wordt verondersteld worden geïmpliceerd. Zij kunnen tot sommige kanker veroorzaken of bijdragen.

Soort Mycoplasma

De soort Mycoplasma is één van verscheidene soorten binnen de klasse Mollicutes. Mollicutes is bacteriën die kleine genomen hebben, een celwand niet hebben en een lage gC-Inhoud (18- 40%) hebben.

Er zijn meer dan 100 erkende soorten van de soort Mycoplasma. Hun genoomgrootte strekt zich van 0.58 1.38 megabase-paren uit. Mollicutes is parasieten of commensals van mensen, dieren (met inbegrip van insecten), en planten; de soort Mycoplasma is per definitie beperkt tot gewervelde gastheren. De cholesterol wordt vereist voor de groei van soorten van de soort Mycoplasma evenals bepaalde andere soorten van mollicutes. Hun optimale de groeitemperatuur is vaak de temperatuur van hun gastheer als (b.v. 37 graden van Celsius in mensen) of omgevingstemperatuur warmbodied als de gastheer zijn eigen interne temperatuur niet kan regelen. De analyse van 16S ribosomal opeenvolgingen van RNA evenals de geninhoud stellen sterk voor dat mollicutes, met inbegrip van mycoplasmas, aan of Lactobacillus of de tak van het Clostridium van de phylogenetic boom (Firmicutes sensu stricto) nauw verwant zijn.

Cellenvariëteiten en Mycoplasmas

In celculturen, kunnen mycoplasmas cellulaire veranderingen, met inbegrip van chromosoomaborations, veranderingen in metabolisme en de celgroei veroorzaken. De strenge mycoplasma besmettingen kunnen een cellenvariëteit vernietigen of dure of kostbare cellenvariëteiten nutteloos maken.

De Verontreiniging van de Cultuur van de cel met Mycoplasma

Mycoplasmas wordt vaak gevonden in onderzoeklaboratoria als verontreinigende stoffen in celcultuur. Mycoplasmal verontreiniging van de celcultuur komt wegens verontreiniging van individuen of vervuilde het middelingrediënten van de celcultuur voor.

Mycoplasma de Methodes van de Opsporing

Mycoplasma de cellen zijn gewoonlijk kleiner dan 1 µm en daarom vrij moeilijk om met conventionele de microscopiemethodes te ontdekken. De technieken van de opsporing omvatten:

• PCR
• PCR in real time
• Plateren op gevoelige Agar
• De vlekken van DNA met inbegrip van DAPI of of Vlek Hoescht

Mycoplasma van de Vlek van Hoechst het Protocol van de Opsporing van de Verontreiniging

Hoechst (Sigma, catalogus #: H6024) bevlekkend methode voor Mycoplasma:

1. Voor Adherente cellen, plaats een steriel dekkingsglas in petrischaal. Voeg 2-3 dalingen van celopschorting in het midden van toe coverglass (afhankelijk van het groeipercentage van uw cellen).
2. Dan voeg zorgvuldig 2-3 ml van middel zonder de cellen toe te storen. Kweek de cellen tot zij 50 samenvloeiende -70% zijn.

Bevestigende Cellen:

1. Bereid celFixatief voor dat een Methanol van mengelingsFO 3:1 is: ijzig azijnzuur (M: AA). Zorg ervoor u v3o3or gebruik vers dit voorbereidt.
2. Verwerp middel van het kweken van cellen. Voeg 2 ml van de Methanol toe: ijzig azijnzuur M: De oplossing van aa druppelsgewijze op de kant van de plaat (niet direct op de cellen). Wervel de plaat en verwerp oplossing.
3. Voeg 2 ml van M toe: Aa, werveling en verlof 2-3 minuten bij kamertemperatuur.
4. Verwerp M: De oplossing en de spoeling van aa met water
5. Het verlof om (u kunt de plaat houden tot u bereid bent te bevlekken) Hoecht de concentratie van de vlek (cat# 33258 van Sigma) voorraad aan de lucht te drogen = 0.1 mg/ml in water u kunt filtreren steriliseert in dit stadium het gebruiken van een 0.2uM container van de filterOmslag in de Opslag van de aluminiumfolie bij 4 oC het Werk oplossing voorbereidt vers maakt 1:1000 elke keer zonodig verdunning (0.1 µg/ml) van voorraad in water

Het bevlekken van Cellen:

1. Voeg genoeg vlek van Hoechst toe om de volledige dekkingsmisstap (gebruik 1-2ml voor een kleine Petrischaal) te behandelen.
2. Verlaat de vlek 45 minuten - 1 uur (in dark).
3. Spoeling goed met water.
4. Zet op een microscoopdia op (mountant mengeling: 22 mm van het Citroenzuur; 55.6 mm disodium fosfaat; 50% glycerol, pH mengeling aan 5.5) plaats een daling of twee op dekkingsmisstap (cellen omhoog) en de misstap van de plaatsdekking (cellen neer) op dia.
5. Visualiseer onder fluorescentiemicroscoop

Nota: de vlek van opslagHoechst bij 4oC minstens, of gedeelte in de diepvriezer voor opslag op lange termijn.