Allen over polyclonal Antilichamen.
Polyclonal Antilichaam bracht Externe Middelen met elkaar in verband - Protocollen:
Ook de Post van het bezoekAntilichaam voor meer op Polyclonal Antilichamen. Het is een nieuwe plaats die de leveranciers van het lijstenantilichaam, over antilichamen, en protocollen leren.
Polyclonal antilichamenprotocollen:
Polyclonal Antilichaam
Polyclonal antilichamen zijn antilichamen die uit vele B-Cellen of B-Cel lijnen, gelijkend op het mengsel van antilichamen worden afgeleid die in bloedserums worden gevonden.
Polyclonal antilichamen zijn daarom een mengsel van vele verschillende antilichamenspecificiteit.
Polyclonal gekochte antilichamenvoorbereidingen zijn mengsels van antilichamen van vele verschillende specificiteit aan het zelfde antigeen.
De immunisering van een konijn, muis, geit, kip, of ander dier produceert polyclonal antilichamen. De dierlijke serums kunnen direct worden gebruikt, nochtans is het beter om polyclonal antilichamen voor laboratoriumgebruik te zuiveren.
Polyclonal Voorbereiding van het Antilichaam
Gebaseerd op het protocol door Dr. David Bowtell
De injecties zouden om muizen voor de generatie van polyclonal antilichamen te immuniseren met intervallen van minstens twee weken apart moeten worden gemaakt.
De volgende 2 hulp is succesvol geweest:
- De hulp van Freund en hulp MPL+TDM (RIBI ImmunoChem Onderzoek, Inc.). MPL is minder gevaarlijk dan de eerste hulp.
- Voor de eerste immuniseringsinjectie: spuit 15 - 50 ug in als Antigeen in 200 onderhuids ingespoten ulhulp.
- De tweede injectie zou 2 later weken moeten voorkomen; U moet dan met 15 - 50 ug van Antigeen in hulp opvoeren. (Als de tijdvergunningen, opnieuw een maand later opvoeren).
- Zeven tot 10 dagen tappen later de muis en het testserum af gebruikend de analyse die voor onderzoek zal worden gebruikt. Als de titer niet hoog genoeg is, voer opnieuw twee weken na vorige verhoging op.
BOVENKANT
- Na het verzamelen, zou het bloed moeten worden toegestaan om voor 60 min. bij 37°C of O.N bij 4°C. te klonteren.
- Scheid de klonter van de kanten van de buis (het bellen) gebruikend een pasteurpipet. Plaats klonter bij 4°C O.N.
- Rotatie bij 10000 x g voor 10 min. bij 4°C om het serum te scheiden.
- Het serum kan bij -20°C worden opgeslagen na het toevoegen van Glycerol aan 50%.
Als worden monoclonal antilichamen gewenst, zodra u een „goede“ polyclonal en betrouwbare onderzoeksmethode hebt aan de volgende stap te werk gaan.
BOVENKANT
De konijnen zijn hoofdzakelijk geïmmuniseerdt zoals hierboven beschreven. Injecties:
- Eerst in de volledige 100-200ug/1ml injectie van Freund, twee plaatsen (over elke schouder).
- Tweede 1 maand later in Freund ONVOLLEDIG zoals hierboven.
- Aftappen 2 later weken. Verhoging 2 weken later opnieuw (2 + 2 weekcyclus).
BOVENKANT
PRODUCTIE VAN POLYCLONAL ANTILICHAMEN BIJ KONIJNEN (WIT NEUSEELAND)
Gebaseerd op het protocol door Dr.Walter Steffen.
De konijnen zouden 3-4 kg in gewicht en ongeveer 3 maanden oud moeten zijn. Een ongeveer derde van het konijn heeft endogene anti-keratineantilichamen en immunoactivity voor verschillende andere cellulaire componenten. Dit benadrukt het belang om pre-immuun serum van om het even welk bepaald konijn te nemen.
Buffers en Oplossingen:
- De verzadigde oplossing van het ammoniumsulfaat, 2 mmEDTA, pH 8.0
- 50 mm ammoniumacetate, pH 8.0
- 70% ethylalcohol
- De hulp van Freund (volledig & onvolledig)
- Fosfaat voor als buffer opgetreden zout (PBS) (zie verder)
- Vaseline
- Xyleen
BOVENKANT
- Breng het konijn van zijn kooi en plaats het die veilig in een beperkende doos het oor toegankelijk verlaat. Houd vrij de konijnrust. De volumes van bloed tot 50 ml kunnen gemakkelijk uit de belangrijkste slagader bijeengezocht=worden= die het centrum van de dorsale oppervlakte van het oor reduceert.
- De scheerbeurt verliet oor rond linkerader met een vers scheermesblad.
- Zwabber oor met 70% ethylalcohol of isopropanol.
- Zwabber oor met xyleen rond slagader-ader uit te zetten lijn.
- Houd het uiteinde van het oor (stevig) en de inzamelingsbuis in één hand en met het vrije handtussenvoegsel een 19G onderhuidse naald in de uitgezette slagader. Het bloed zou moeten beginnen onmiddellijk in de inzamelingsbuis te stromen. Voor beste gebruiken de resultaten een gedeelte van slagader centraal langs het oor.
- Verzamel tot 50 ml- bloed. Pas druk enkel voorafgaand aan punt van ingang van naald toe ophouden aftappend.
- Pas Vaseline op oor aan de irritatie van het soothexyleen toe.
- Zet extra Vaseline op besnoeiing.
Het verkrijgen van Serum:
BOVENKANT
- De buis van de werveling met verzameld bloed om oppervlakte met een laag te bedekken en klontergehechtheid aan buis te verhinderen.
- Broed bij 37 oC 1 uur uit.
- Centrifugeer bij 2.500 g (het plaatsen #7 in een klinische lijstbovenkant) voor 10 min.
- Verwijder klonter en rotatieserum bij 3.000 g voor 10 min.
- Het serum zou moeten worden opgeslagen bevroren.
De Precipitatie van het Sulfaat van het ammonium van IgG van Serum (4 oC, die in koude ruimte wordt uitgevoerd):
De het sulfaatprecipitatie van het ammonium is een gemakkelijke methode om een vrij zuivere fractie te verkrijgen IgG.
BOVENKANT
- Het serum van de pool van één konijn
- Het serum van het gewicht
W1 = _____ g
- De buizen van de was met min. PBS en wegen opnieuw.
W2 = _____ g
- Voeg 2/3 volume van W2 verzadigd ammoniumsulfaat toe, 2 mmEDTA, pH 8.0
Nota: voeg zeer langzaam, druppelsgewijze toe terwijl het bewegen bij 4 oC of gebruik peristaltische pomp.
- Beweeg voor 15 min.
- Overdracht aan de buizen van de 40 mlcentrifuge; was beker met 3 delen van PBS: het sulfaat van het 2 deelammonium en voegt aan buizen toe.
- Rotatie bij 12.000 g (Beckman ja-20: 10.000 t/min) voor 10 min.
- Verwerp bovendrijvende substantie.
- Stel korrel in PBS [1/2 W1 = 1/2 volume] opnieuw uit.
- De rotatie bij 12.000 g voor 10 min, verwerpt korrel.
- Verzamel bovendrijvende substantie in beker, wasmuren met PBS.
Bepaal W3 = _____
- Voeg 2/3 sulfaat van het volumeW3 verzadigd ammonium toe, terwijl het bewegen. Blijf bewegend voor 15 min.
- Breng opschorting naar de buizen van de 40 mlcentrifuge over, wasbuis met PBS/ammonium sulfaatoplossing.
- Rotatie bij 12.000 g voor 10 min.
- Verwerp bovendrijvende substantie.
- Stel korrels in 1/4 W1 PBS opnieuw uit.
- Dialyseer tegen PBS, 3 keer 6 uren elk.
- Zet goed serum in een gediplomeerde buis, de zak van de spoelingsdialyse met PBS.
- Breng tot 1/2 W1 = 1/2 volume in PBS.
- Bepaal eiwitconcentratie en gedeelte voor opslag. Meet de absorptie bij 280 NM. De absorptie van 1 mg/ml de oplossing van IgG is ongeveer 1.5.
Immunisering:
BOVENKANT
- Los ~400-600g antigeen (~200-300 g per injectie) in 2.2 ml op 50 mm ammoniumacetate, pH 8.0 of ander aangewezen buffer. De concentratie hangt van antigenicity van in te spuiten proteïne af.
- De hoeveelheid antigeen nodig om een dier te immuniseren hangt van het af antigenicity en de methode van immunisering. Als de proteïnen met lage antigenicity worden gebruikt, zal het nuttig zijn om de proteïne met een lage concentratie van SDS (tot 0.2%) te denatureren. Slechts zou het hoogst gezuiverde antigeen voor de productie van polyclonal antilichamen moeten worden gebruikt. Een gemakkelijke methode om een zuiver antigeen te verkrijgen is door SDS-PAGE. De proteïnen kunnen naar een blad van nitrocellulose worden overgebracht, met Ponceau S worden bevlekt, met een scheermesblad worden verwijderd, en als antigeen (zoek standaardprotocollen in sds-PAGINA) worden gebruikt.
- Stel 1.1.mlFreund volledige hulp met een 20G onderhuidse naald op, dan stel 1.1 ml antigeenoplossing op. Bevries het blijven 1.1 ml voor verhoging.
- Houdend de duiker onbeweeglijk, verwijder de naald en maak een steriele 3 manierplugkraan vast.
- Meng het antigeen met de hulp door een tweede glasspuit vast te maken aan de plugkraan en afwisselend in te spuiten. (Voorzichtigheid: sommige plastic spuiten zouden met de minerale olie kunnen reageren.)
- Een volledige emulsie zal na ongeveer 20-30 min worden gevormd; vermeld door een eerder plotselinge verhoging van viscositeit van de oplossing.
Voorzichtigheid: zeker ben dat de steun veilig is!
- Na zich het mengen wacht ongeveer 20 min vóór te controleren injectie dat het mengsel (als onvolledig, olie zal scheiden) volledig is.
- Scheer terug van konijn van schouderbladen aan bekken.
- Maak terug met 70% ethylalcohol of isopropanol schoon
- Spuit onder de huid in in ongeveer 10-20 kanten langs de stekel tussen schouderblad en bekken gebruikend een 21G onderhuidse naald. (Nota: Eerste injectie één week na laatste preimmune die aftapt).
- Wacht één maand en voer met een mengsel van antigeen en onvolledige hulp op. Vermijd littekens van vorige injectie.
- Aftappen na één week om immuun-reactie te controleren. De verhoging zou moeten worden herhaald, als de immune reactie te zwak was; nochtans, zou een verschillend konijn moeten worden gekozen, als het konijn helemaal niet reageerde. /LI >
Verwijzingen: Garvey, J.S., Cremer, N.O., & Sussdorf, D.H. (1977) in: Methodes in Immunologie. Pub. Benjamin/Cummings Publishing Company. De Massa van lezingen. pp 545
BOVENKANT Onderzoek van Polyclonal Antilichaam dat Analyse ELISA gebruikt
Protocol ELISA voor het Scherm van het Antilichaam:
Materialen voor ELISA:
° Platen - 96 goed Dynatech Immulon, type 2. (Visser 17-0221-199).
° PBS, TBS
° PBS + 0.1% Tween 20 of TBS + 0.1% Tween 20.
° Het blokkeren oplossing = 2% BSA (type V) in PBS. (Voeg 0.02% azide voor langere opslag toe.)
Buffer ° Elisa = 2% BSA + 0.1% Tween 20 in PBS (facultatief azide).
° Enzym verbonden antilichaam = peroxidase 1 van de Mierikswortel
° Substraat = ABTS - 100X (van Zymed 00-2001) 1
Buffer ° HRP: 100mM het Citraat pH 4.2 van Na (490 mg citroenzuur + 720 mg van Na het citraat
dihydraat + 50 ml H2O, pH 4.2).
° Peroxyde van de waterstof 30% (1000X)
BOVENKANT
1) ADSORBTION VAN ANTIGEEN
a) Verdunde Ag aan 10 ug/ml in PBS.
B) voeg ul 100 goed van Ag oplossing aan elk toe.
c) verlaat O.N die met saran omslag, bij 4°C. wordt behandeld.
2) het BLOKKEREN
a) Was losgemaakte droogt Ag door de platen om te keren en de putten flicking.
B) Spoeling door PBS goed toe te voegen aan elk en het opnieuw om te keren (gebruiks squirt fles).
c) herhaal tweemaal de spoeling.
D) voeg ul 100 van het blokkeren van oplossing aan elk toe goed, verlaat 1 u bij ruimteTemperaturen of O.N bij 4°C.
3) PRIMAIR ANTILICHAAM
a) voeg het te testen antilichaam toe:
Sup van cellen = 25 ul, mengeling goed door (10 keer) op en neer pipeting.
serum, buikwaterzucht = 1:100 en een serie van 1/5 verdunningen. Doe verdunningen in het blokkeren van oplossing.
B) verlaat 1 u bij ruimtetemperaturen of O.N bij 4°C.
4) SECUNDAIR ANTILICHAAM
a) Was losgemaakt antilichaam 4 keer met PBS + 0.1% Tween 20.
B) voeg ul 100 van enzym verbonden antilichaam aan alle putten toe. Doe de aangewezen verdunningen in de buffer Elisa. (ex: HRP is 2000X).
c) Verlof 1 u bij ruimtetemperaturen of O.N bij 4°C.
5) SUBSTRAAT
a) substraat Disolve in water.
B) de plaat van de Was 4 keer met PBS + 0.1% Tween 20 (gebruik TBS in plaats van PBS voor AP).
c) voeg ul 100 goed van substraat aan elk toe.
D) let kleuren op ontwikkeling. Dit kon uit een paar seconden aan 20 min. nemen.
e) indien nodig, houd de reactie door ul 50 van 4M NaOH tegen toe te voegen.
F) lees absorptie in lezer Elisa bij correcte golflengte (voor systeem HRP 416 NM, voor AP - 405 NM).
BOVENKANT
De Protocollen van het antilichaam
De Producten & de Diensten van het antilichaam
Het Bulletin van het antilichaam
Andere Websites van het Antilichaam
Zie de Post van het Antilichaam een nieuwe plaats is die antilichamen, antilichamenleveranciers, en andere op antilichaambetrekking hebbende informatie behandelt.
Vind andere antilichaam en Verwante Monoclonal onderwerpen van het Antilichaam hier:
Verzend deze pagina naar een vriend 
![[أربيك]](http://www.molecularstation.com/translate/images/flag_ar.gif){kind=small}
