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과학은 그것의 제일에 간단하게 상식 이다. ~ThomasHuxley
고품질을 얻어서, 본래RNA은 북부 분석, 늦러앗어 보호 분석실험,RT-PCR, 지도로 나타내는RNA, 시험관 내 번역 및DNA도서관을 포함하여 많은 기본적인 분자 생물학 실험을, 실행하기안에 첫번째 그리고 수시로 중요한 단계 건축 이다. 성공적, 그런데,RNA격리 절차 이음것은 실제적인RNA정화전후에 몇몇 중요한 단계를 양쪽 포함해야 한다.
추출될 것이다RNA의지하고 있는, 그것을 단백질,DNA및 조차 지질 다른 세포질 물자에서 멀리 고립시키는 두는RNA의 재산 있는다.
메신저RNA또는mRNA은poly(A)꼬리의 모양으로 뻗기 아데노신 잔류물을 포함한다. mRNA을poly(T)친화력 란 또는 구슬에 도약되는 허용하 도록 이것은 개발되었다.
너는 현재RNA을 고립시키기를 위해 좋아한 방법이 있으면, 그것을 이용하기 위하여 계속하십시요.
너의 유기체가 뒤에 오는 명부에 전에 너가 너의 시스템에서RNA을 고립시키지 않으면, 우리는 너가 북부에게 더럽히기를 위해RNA또는 너의 시스템에서RT-PCR을 고립시키기를 위해 사용된 설치한 프로토콜을 확인할것을 돕l 수 있고. 프로토콜의 이 유형은 또한 "microarray급료"RNA을 열매를 산출할 것이다.
항상 질을 사정하기 위하여 너의RNA의 아g아r옷어 젤을 달리십시요.
주: 너가 우리가 너를 침전시키는 너의RNA을 에타놀에서 두번 째 추천하나TRIzol 무 란에 의하여 기초를 두는 정화 시약을 이용하면 너는Rneasy란 또는 유사한 장치를 통해서 그것을 통과한다. 이것은 모든 유기 오염물질의 제거를 확실히 한다 (스펙트럼을 아래에 보십시요).
능률적인nuclear/cytoplasmic분별법은 변성시키는 아g아r옷어 젤 분석에의해 빠르게 사정될 수 있는다 (숫자 1)을 보십시요. 선구자rRNA에 해당하는 악대는 총계와 핵RNA조각안에 동등해야 한다. 18S과28SrRNA악대는 합계RNA세포질 조각RNA안에보다는 핵RNA조각안에 보다 적게 강렬할 것이다. 몇몇 세포 선, 예를 들면293과COS-7세포안에, 이 다름은 극적 이을 것이다, 그러나HeLa세포같은 다른 세포 선안에,rRNA악대는 총계 세포질 조각RNA안에보다는 핵RNA안에 약간만 보다 적게 강렬하다."
A260독서와 비율260/280은 높은 순수성RNA을 지키는 이젠 그만. 너는 충분한UV스펙트럼을 가지고 가야 한다. 의 밑에 모두에는 비율 좋은260/280이 있는 3개의 보기 스펙트럼에는 있고, 그러나 아주 다른 순수성이 있는다. 너는 결정한다 너의RNA안에 유기 오염의 총계를 또한 도움에260/230비율을 사용할 수 있는다. 260/280비율보다는 훨씬 변하기 쉬운 수 이다, 그러나 일반적으로, 1이상 비율은 좋은 순수성을 지적한다.
세포는PBS안에 그때 세척되고 묘사된대로 계속되 추출했다. 첫째로, 세포는NonidetP-40버퍼 (10 밀리미터, (pH7.5)에, 10 밀리미터,MgCl2NaCltrisCl3개 밀리미터,0.5%(v/v)NonidetP-40,40units/mlRnasin, 1개 밀리미터DTT) 추출되었다. 잔여 펠릿 (거친endoplasmic봉소위 (RER) 및 핵)은 동일한 버퍼안에 세척되고 버퍼B(10 밀리미터 (pH7.5)안에,NaCltrisCl10 밀리미터,0.5%(v/v)NonidetP-40의40밀리미터EDTA,40units/mlRnasin, 1개 밀리미터DTT) 추출되었다. 잔여 핵 펠릿은 동일한 버퍼안에 세척되고 높은 소금 버퍼 (10 밀리미터 (pH7.5)에,0.5MNaCl,MgCl2trisCl3개 밀리미터,0.5%(v/v)NonidetP-40,40units/mlRnasin, 1개 밀리미터DTT) 추출되었다. RNA은RNASTAT해결책에의해 각 조각에서 순화되었다. 총계RNA은RNA-STAT60시약을 사용하여 제조자에의해 제공된 명령에 따르면 (전화 시험) 고립시켰다. (참고: Byeong-ChurlJang그 외 여러분,2002)
100개의mls를 위해 200의mls
4. sarcosyl)2.0g4.0g50mM5MGuanidinium티오시안산염53.2g106.42%N-lauroylsarcosine(EDTA0.5M10의mls20의mls25mMTris-HCl의 pH7.51M2.5mls5개의mls
0. 1Mbb-머r잡도XX안올700ul1.4mls
0. (시그마)2%소포제A200의 을400의 을
5. 7개MCsCl방석*마지막 양 100ml
5. 7개M은CsCl95.8g을 "구웠다"
0. 1MEDTA0.5M20의mls
* 사용DEPC은 근해를 대우하고 유리 그릇을 구웠다. 이 해결책은, 절대로, 긍정적으로Rnase자유롭게 해야한다. Rnase은 어디에나 있는다! 착용 장갑은, 단 굽n 유리 그릇, 또는 처녀 플라스틱을 이용한다. DePC치료 너의 근해, 버퍼 (Tris을 제외하고). 아주 주의깊 있으십시요.
1. 동물을 무게를 달십시요. 기관 (간)을 제거하고십시요,DNA의 우량한 속성의 한을 있는다 너 감소한다 단multilocus효소의 단순한 소재시를 내색하는 기관을 선택해서 유전자 복합성을 무겁게 하십시요. 2. "혼돈" 버퍼 (9mls)안에 직물을 급속하게 3 균질화하십시요. 불용해성 물자 4을 제거하기 위하여12킬로그램에homogenant회전시키십시요. Homogenant이4쥱을 회전시키고 있는 동안. 견본당CsCl(0.2g/ml)의1.8g을 재십시요. 4B. 방석 초원심 분리기 관 ("빠르 물개")안에5.7MCsCl"의3.5mls을 추가하십시요" 이 층이Rnase자유롭게 해야하는. 너는 이 층으로 너의RNA을 원심 작용을 받게 하고 어떤 오염은 뜻깊을 손실을 일으키는 원인이 될 것이다. 5. supernant, 신선한 관으로 둬 제거하고십시요,1.8gCsCl6을 추가하십시요. 주의깊게,CsCl방석의 위에homogenant추가하십시요. 이것은10cc주사통 및 긴 바늘을 사용해서 준비되어 있 달성된다. needle/syringe을 빠르 물개 관으로 두고, 주사통에homogenant직물을 추가하십시요. Homogenant은 방석의 위에 이초하는Q-S관으로 느리게 샐 것이다.
7. 주의깊게, 분리기 관의 균형 쌍체 비교 (+/-0.0050.005g).
8. 물개 관, 장소는 빨간 알루미늄 정상 서로와 모자의 관 반대말을 맞췄다.
9. 분리기,50,000의rpms5.5시간,20oC
원심 분리다음에: 펠릿이 있는 일 것이는 곳에 표 관: 밑바닥 외부 측에 (회전자의 센터에 관하여)
10. 관, 편리한 선반안에 장소를 제거하십시요.
11. 해결책의 최고2/3-3/4떨어져tube.Aspirate의 정상떨어져 저미십시요. 정상에서 아래로 일하십시요. 너가 갑피떨어져 가장 큰 해결책을 첫째로 발음하고 모두 그러나 명확한 방석을 제거한다 고 중요하다. 바닥에 보이지 않는 펠릿을 발음하지 말라.
12. 관의 최고2/3을 차단하십시요. "당긴"Pasteur을 사용하여 잔여 해결책을 피펫으로 옮기고십시요, 주의깊게 제거하십시요. 펠릿은 관의 바닥 측에 있을 것이다.
13. 70%EtOH에 두번의 행구기 펠릿은, (사용Pasteur은 피펫으로 옮긴다), 반복 제거한다 (합계 3은 세척한다)
14. 으깸 펠릿과 해결책으로 펠릿을 두는T.E.시도를 "적정하기"에 피펫으로 옮기 끝RNase을 사용하여0.1xTE(자유로운)의 200의 을을, 추가하십시요. 적어도 이질적인 해결책을 형성하고 신선한microfuge관으로 두십시요.
15. 양쪽 해결책을 합동하는T.E.의 200의 을에 반복
16. 와동은, 좋은RNA해결책으로 가고 싶지 않는다. 끈기는 미덕 이다.
17. 농도,490의 을 (500의 을 마지막vol.)으로 10의 을을 결정하십시요
18. 젤 분석을 위해RNA의 1 에 2 으g을 제거하십시요 (RNA선적 버퍼를 추가하십시요)
19. 1/10(40의 을) 양Rnase자유롭게3MNaOAC,EtOH(1.0ml)의2.5양을 추가하십시요. 활기차의 혼합.
20. 너의RNA의 모두를 즉시 침전시키는 너는, 거기서 필요EtOH.Thus안에RNA의 농도를 산출할 수 있는다. 다만 대략1.5에 2 번을 너가EtOH/RNA해결책을vortexing서 필요로 하는 총계 제거하고 적당한 양을 제거하십시요. 20oC에 저장되는 이EtOH/RNA해결책은 또는 수년간 안정되어 있는다 낮추고.
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