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생활의 가장 슬픈 양상은 지금 과학이 지견을 사회 집결 지혜보다는 빨리 모인다 고 이다. ~IsaacAsimov의 과학과 성격Quotations1988년의IsaacAsimov's책

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북부 오점

저작권2007년은 - 분자 역

오디오 상세한 북부 오점 설명을 들으십시요!

북부에게 더럽히기의 역사

북부에게 더럽힘것은 스탠포드 대학 (ref:1)에Alwine그 외 여러분에의해1977년에 개발된RNA더럽히는 기술 이다. 그것은DNA을 위해 더럽히는 EdwinM. Southern에의해 발명된 남쪽 오점 기술다음에1975년에 지명되었다. 서쪽 오점은, 단백질을 위해 더럽히기를 위해 방법 또한 지명하는 남쪽 오점에 놀이 이고1981년에 지명되었다 (ref:2).

백그라운드 정보 - 북부 오점 기술

실시간PCR, 늦러앗어 보호 분석실험 (RPAs) 및microarrays의 첨단 기술 세계안에 그것의 나이에도 불구하고 북부 분석은, 아직도mRNA수준의 탐지 그리고 q으안딛XX이온을 위해 금 표준 이다. 북부 오점 분석이 단순한 막에 견본사이 메신저RNA풍부의 직접적인 비교를 허용하기 때문에 이것은 이다.

북부 오점안에 다른 더럽히는 기술사이 주요한 다름은RNA이 검출되는 요인 이다 고 이다. 또한,RNA이 흔하게 단순하 배가 좌초한다 고 사실, 그것은에 만기가 되는 그것의 이동을 영향을 미치고 지금부터 조건을 변성시켜서 젤을 달리는 사용되는 복잡한 이차 구조를 만들는다 (남쪽과는 다른).

RNA은RNA젤 전기 이동법 ( 흔하게 아g아r옷어 젤 전기 이동법), 막에 연속적인 이동, 조사에 교잡, 및 마지막으로 탐지에의해 밖으로 분리한다.

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남쪽에게 더럽히기에 유사하게, 교잡 조사는 북부에게 더럽히기안에DNA또는RNA이을지도 모른다.

반전 북부 오점으로 있있던 절차의 이체는 임시로 (, 드문으로) 사용되었다. 이 절차안에, 핵산 고립시킨DNA파편의 수집, 및 조사 이는 (막에 부착되는) 기질은 직물에서 추출되고 방사성으로 레테르를 붙이는RNA이다.

그들이 기질에 부착되는 고립시킨DNA파편의 사용을 관련시킨다 고 1990 년대와 이른2000s후반에 대폭적인 사용에 들어온DNAmicroarrays의 사용은 세포질RNA에게서 하는 조사에 반전 절차, 안에, 및 교잡에 더 가깝다. 윤곽을 그리는 유기체안에 유전자의 많은 것에는 (가능하게 모두) 그들의 표정이 있을 수 있는 유전자 발현으로 진화할 것이다 북부 분석을 사용하여 유전자 발현의 1 에 시간 학문이라고 가능하게 하는 따라서 원래 드물었던, 감시했다 이긴 하지만 반전 절차는,

북부 오점의 응용

북부 오점은 실시간PCR및microarray접근에 의하여 가장 큰 지역안에superceded이었다. 그것은 임상 진단상 목적을 위해 수시로 사용하지 않는다.

북부 오점 프로토콜 및 그것의 변이는 분자 생물학 연구안에 그런데 사용된다:

mRNA(메신저RNA사본)의 수준에 유전자 발현의 직접적인 학문을 위해 금 표준.
mRNA사본 크기의 탐지
학문RNA강직
학문RNA접합 - 양자택일로 접합한 사본을 검출한 할 수 있는다
RNA반감기를 공부하십시요
학문 분노 (내부ribosomal등록 사이트) - 제 2cistron번역대RNA소화의 가능성을 제거한 위하여.
수시로transgenic/녹아웃 쥐 (동물)을 확인하, 검사했었다

북부에게 더럽히기의 불리

북부에게 더럽히기 사용하기의 불리는 포함한다:

수시로 방사능은 사용된다. 이것은 그것, 사용 및 처리를 실행하기의 용이를 방지한다. 비방사능 탐지의 새로운 방법은 생성해 비방사능 탐지를 허용한. 피어스를 보십시요.
북부에게 더럽히기의 전체 프로세스는 탐지에게 견본 준비에서 장시간을 흔하게, 처음부터 끝까지 걸린다.
경미하게RNases이 타락하는RNA견본이 동등하면, 표정의 데이터 그리고 q으안딛XX이온의 질은 확실히 부정적으로 영향 받는다.
표준 북부 오점 방법은 늦러앗어 보호 분석실험과RT-PCR보다는 관계되 보다 적게 과민하다. 북부 오점의 감도는 나일론positively-charged막의 사용, 높게 명확한antisense조사의 사용에 증가할 수 있는다.
다각 조사에 탐지는 문제 이다. 수시로, 막은 제 2 조사에 교잡 그리고 탐지의 앞에 벗겨야 한다. 오점에서 떨어져 조사를 벗길기것을 가혹한 조건이 요구되고기 또한 시각이 걸리기 때문에 이것은 문제 이다. 또한, 오점이 벗길 수 있는 소요 시간에 한계 있는다.

북부에게 더럽히기의 이점

북부 오점의 이점은 포함한다:

넓게 받아들이고 잘 주시한 방법 이다
북부에게 더럽힘것은 똑바른 방법 이다
수시로 그것은 견진 또는 검사로 사용된다
수시로 금 표준
조사 (실시간PCR대) 포함의 많은 유형의 사용법을 허용하기 수 있기 때문에 다재다능한 프로토콜 이다: 뇌관 방사선과 무 방사선의, 시험관 내 베낀RNA그리고 조차 올이g온읒러XX이d엇.
실시간PCR다른 방법과는 다른 조차 부분적인 상동에 순서는, 교잡 조사 수 있는다 (상동 분석을 위해 다른 종에서i.e순서는,또는genomic파편으로 사용될 수 있는다) 사용될.

북부 오점 프로토콜

언급해 대로 북부에게 더럽히기안에 단계는 포함한다:

RNA격리
별거를 위해RNA의 젤 전기 이동법
막에 이동 (RNA으로 흔하게positively-charged나일론은negatively-charged이다)
막에RNA의Cross-linking(흔하게 UV 교차 결합시키나 화학제품 평균에 의하여)
교잡
탐지

물자는 북부 오점 프로토콜을 위해 필요로 했다

버퍼 조리법

20XSSPE(500ml)

3.6MNaCl: 105.2g
0. 2M인산염 버퍼 pH7.0: 1M의100mL
20mMEDTA: 0.5M의20mL

인산염 버퍼pH7.0(500ml)

NaH2PO4(1M의 1염기)140ml
Na2H2PO4(1M의 이염기)360ml
양쪽다음에7.0에 pH은 추가된다

교잡 버퍼=HB(100mls)

5XSSPE: 25mls20X
2%SDS: 20의mls10%

** 전에을 사용하여 우측1000ug에 의하여 변성시키는RNAse자유롭게CTDNA(변성시킬 것이다 3 분을 위해95즣에 열)5000ug효모RNA을 추가하십시요

세척: 2XSSPE+0.1%SDS(500의mls)50의mls20X5mls10%SDS=0.1%SDS

RNA젤 (1L)을 위해 운영하는 버퍼

100개의mls10X은 청소한다
52. 포름알데히드의 6개의mls
847. 4개의mlsH20

RNA젤 (70ml)

0.84g아g아r옷어
7개의mls10x은 청소한다
58.38mlsH2즁
난방에 의하여 해결책안에 젤을 두십시요. 60캜에 차가운 젤을 시키고십시요, 동등한 것에 그때 포름알데히드를0.66M--3.78mls추가하십시요
가능한 만약에 증기 두건안에 젤을 따르십시요

북부 오점을 위해RNA견본

RNA 격리와 정화를 보십시요

RNA젤

RNA을 고립시키기다음에,RNA은 젤 (흔하게 아g아r옷어)에 밖으로 분리해야 한다.

RNA 젤을 보십시요

나일론 막 프로토콜에 북부 오점 이동

RNA젤을 달리기다음에,posiblotter에 두는 증류수에 젤을 세척하십시요.

정상에서 바닥에 층은 아래와 같는다:

갯솜
3-4크기에Whatman종이 커트 (이들 모두 위 상기는10XSSPE그러나 똑똑 떨어지지 않는다안에 적셔야 한다)
젤 가면.
주: 젤의 정상의 선에 막을 계인할 수 있고 우측 최고 구석이 구멍에 경미하게 더 큰3M서류상 단단한 플라스틱 3개 조각 표를 했다 하기 위하여 젤 오바레이는 가면 확인한다

좋은 물개 있는다 것 을 위에의 죔쇠는 확인하고. 1 시간 더를 위해 압력의 사용75-80밀리미터 헥토그램.

건조한 오점 막

Cross-linking나일론 막 - 북부 오점 프로토콜

사란 포장안에 오른쪽 구석 꼭대기 포장을 자르십시요.
아래로의UV2.5분을 위해RNA측에 비추십시요.
뜨거운2XSSPE/0.1%SDS해결책 (50%힘안에 2 분을 위해에30-45초를 위해 마이크로파 해결책 세척하십시요.
건조한 바람쐬십시요

북부 오점을 위해 전 교잡

전 6 시간 밤새껏을 위해 교배시키십시요
해결책안에SDS을 두기 위하여65캜열HB버퍼에 오븐을 놓으십시요
위로 메시의 조각안쪽에 막을 구르고hybridizatontube(2XSSPE/0.1%SDS으로 두십시요)
기포를 검사하십시요
반대 측에 다른 관에 균형을 잡는 오븐안에 관을 두십시요

북부에게 더럽히기를 위해 레테르를 붙이는 조사

ddH2즁에11uL의 총계 양안에 조사의25ng을 두십시요
@95캜을 3 분 변성시키십시요. 이것은 조사에게 단순한 배가 좌초하는 얻, 능률적인 교잡을 방지할텐데 이차 구조를 제거한것을 이다.
빨리 젖는 얼음에 냉각하십시요. 이것은 조사 단순한 배가 좌초하는, 이차 구조의 자유로운 지키, 허용하지 않는것을 이다 (reannealing또는 이차 구조의 개혁).
4즩l높이 주요한 (BoehringerMannheim)5즩l알파 방사선P-32dCTP3000uCi/mmole20ul합계를 추가하십시요
10-15최소한도37캜을 알을품으십시요
20ul반응에1XTE의2즩l0.5MEDTA의28uL을, 추가하십시요.
1 분을 위해G-25Sephadex란을 전 회전시키십시요.
50ul견본을 란에 추가하고 임상 분리기안에2.5분을 위해 회전시키십시요. 이것은 레이블에서 조사를 멀리 순화한것을 이다.
멀리의 던짐 란.
0.5mL관안에 새로운 관100ugCT-DNA50ug효모RNA안에 혼합.
95걋� 3 분 변성시키십시요
잡종 관 혼합에 추가하고십시요,20-36시간을 위해65캜에 교배시키십시요

북부에게 더럽히기를 위해 교잡 프로토콜을 배치하십시요

36-48시간을 위해 그때 세척한다 교배시키십시요.

65캜까지2XSSPE/0.1%SDS열 (세척)높은 쪽으로 가열하십시요 (해결책을 데우는 사용 마이크로파 또는 목욕)
밖으로 관을 가지고 가고 뜨거운 방사성 폐기물 콘테이너로 액체를 따르십시요.
10ml세척에 행구기는 이것을 두번 하고 낭비를 밖으로 따른다.
vigoursly세척과 동요의40에50의mls안에 두는.
20최소한도 자전을 위해 교잡 오븐안에 두는.
수채의 아래 따르십시요
오븐안에 다른40-50mls그리고 동요.
밖으로 폐기물 콘테이너 (뜨겁 유독한 수채 그렇지 않으면)에 따르고 확인하십시요 더이상 뜨겁 그때 밖으로 막을 가지고 간다 것 을.
15분을 위해RT에0.1%SDS에0.2XSSPE에 셰이커에 세척하십시요.
건조한 바람쐬십시요
폭로

북부 오점을 위해 끝

너는 현재RNA을 고립시키기를 위해 좋아한 방법이 있으면, 그것을 이용하기 위하여 계속하십시요.

항상 질을 사정하기 위하여 너의RNA의 아g아r옷어 젤을 달리십시요. 뿐만 아니라 분광광도학 결과에 의지하십시요.

* DEPC에 의하여 대우되는 근해 및 굽n 유리 그릇을 이용하십시요. 이 해결책은, 절대로, 긍정적으로Rnase자유롭게 해야한다. Rnase은 어디에나 있는다! 착용 장갑은, 단 굽n 유리 그릇, 또는 처녀 플라스틱을 이용한다. DePC치료 너의 근해, 버퍼 (Tris을 제외하고). 아주 주의깊 있으십시요.

수리 북부 오점