서쪽 오점 정의: 서쪽에게 더럽히는 것은 특정 항체에 묶는 그들의 기능에 근거를 둔 단백질을 확인하고 찾아내기 위하여 이용된 기술 이다.
서쪽 오점 분석은 많은 단백질의 혼합물에서 관심사의 단백질을 검출할 수 있다. 서쪽에게 더럽히는 것은 (kDa에 있는 크기 마커에 비교에 또는 사다리) 단백질의 크기에 대한 정보를 제공할 수 있고, 또한 단백질 표정에 정보를 제공한다 (치료되지 않는 견본과 같은 통제에 비교에 또는 다른 세포 유형 또는 조직).
개요: 서쪽 오점은에 정보를 제공한다:
단백질의 크기
단백질 표정 양
서쪽 오점 분석은 세포 또는 조직에서, 또한 생체외에서 종합했다는 것을 재조합형 단백질을 분석할 다는 것을 어떤 단백질 견본든지 분석할 수 있다. 서쪽 오점은 특성이 이 단백질을 위해 그것 인 방법 당신이 관심사의 단백질을 위해 시험하기 위하여 사용하는 항체의 질 에, 의지하고 있고. 항체는 지금 쉽게 상업적인 근원에서 획득 가능하, 관심사의 단백질을 위해 1개를 구매할 수 있다. 단백질이 비발한 단백질인 경우에, 항체를 너자신 생성하거나 회사를 당신을 위해 그것을 하는 얻어야 한다. 이런 경우에 소량의 세포 추출에서 순화되거나 재조합형으로 한 단백질을 적어도 필요로 할 것이다 (생체외 재조합형 단백질 표정 시스템에서 ie). 단백질에 특정 항체는 서쪽 오점에 단백질의 수천 대신에 관심사의 단백질에 특히 묶을기 수 있기 때문에 서쪽에게 더럽히기 생명 이다!
아래 도표 1을 보십시오. 우선 먼저. 당신이 분석하고 싶은 세포 견본과 같은 단백질 견본을 얻으십시오. 단백질 함량을 풀어 놓기 위하여 세포를 Lyse. 크기를 기준으로 하여 단백질을 분리하는 젤에 이들을 달리십시오. 다음 전기를 사용하여 막에 이 젤 단백질을 옮기십시오. 이 막은 1 차적인 항체를 사용하여 관심사의 단백질을 위해 시험하기 위하여 그 때 사용될 수 있다.
서쪽 오점을 필요로 하는 무엇이라고:
단백질 견본
관심사의 단백질을 검출하는 좋은 항체
서쪽 오점은 1 차적인 항체를 막과 이전에 젤에 단백질의 수천에서 이 단백질을 검출하기 위하여 의지한다! (세포는 30,000의 다른 단백질을 포함할 수 있어 - 이 동일한 단백질은 바꾸이고 조차 300,000의 다른 단백질 이상! 준). 항체를 사용하여 1 차적인 항체 (이차 항체)를 당신이 단백질 항체 항체 샌드위치를 쌓아 올리는 인식한다! 이차 항체에는 가벼운 풀어 놓는 물질로 luminol 기질을 변환하는 말 무 과산화 효소 효소가 있다! 이 빛은 필름에 반점으로 검출된다. 이 반점에서 얼마 단백질이 다른 반점에 관련된 거기 있는, 또는 젤에 또한 달리는 크기 마커지에 관련된 단백질의 크기 결정할 수 있다.
도표 2는 서쪽 오점 보기 젤을 보여준다. 차선 1은 단백질의 다른 알려진 크기를 보여주는 단백질 크기 마커 사다리, 이것 상업적으로 구매될 수 있다 이고 모든 반점의 크기는 팸플릿에서 주어진다. 차선 3은 암 견본이고 차선 5는 일반적인 견본이다. 볼 수 있던 대로 차선 3에 있는 단백질에는 흥미로운 차선 5에 있는 암 견본 보다는 더 높은 표정이 있다. 더구나, 차선 3과 5에 있는 단백질 반점은 같은 차선 1.에서 크기 사다리에 있는 제 2 반점 같은 크기이다. 우리는 그 때 우리가 사다리로 수신한 우리의 브로셔에서 알려진 단백질 크기를 봐서 좋다. 우리는 그 때 단백질의 크기가 80 kDa다는 것을 결정한다. 관심사의 우리의 단백질은 또한 80 kDa이다. 따라서 우리는 서쪽 오점이 작동했다는 것을, 그리고 단백질이 암 견본으로 높게 표현된ㄴ다는 것을 알고 있다!
비 부착한 세포 (T 세포 선 또는 주변 혈구와 같은) 또는 부착한 세포가 (섬유아세포 세포 또는 COS 세포와 같은) 다는 것을 매체에서 외부 단백질을 제거할 필요가 있다. 비 부착한 세포를 위해 온화하게 원심 분리에 그(것)들을 산탄 그 후에 PBS를 가진 펠릿을 세척할 수 있다. 부착한 세포, 간단한 세척 플라스크 또는 서쪽 오점 이전에 PBS를 가진 접시를 위해.
서쪽 오점 분석은 단백질을, 검토하고 그래서 우리는 또한 단백질을 세포에서 방출이곤 그리고 단백질이 프로테아제로 위로 잘리는 것을 막는 원한다. 우리는 서쪽 오점에 이들을 필요로 한다:
- 것을 찬 유지하기 위하여! 서쪽에게 더럽히기를 위한 세포 세포의 용해 도중 얼음에 4C
- 세포의 막을 단백질을 풀어 놓기 위하여 끊도록 세제를 이용하십시오
- 버퍼
- 우리가 인단백질을 위한 서쪽 오점을 하는 경우에 억제물 (프로테아제 둘 다 억제물과 인산 가수분해 효소 억제물)
제정성 - 서쪽 오점을 위한 세포를 Lysing
SDS와 RIPA는 서쪽에게 더럽히기를 사용하여 최신 분석을 위한 단백질을 solubilize 이용되는 세제이다. 이것은 세포 또는 찾아낸 안쪽 세포막 안쪽에 만큼 단백질이라고 이다 요구된다, 그래서 우리는 그(것)들을 위한 immunoblot에 능력 있기 위하여 이 단백질을 풀어 놓을 필요가 있다.
SDS-PAGE 젤은 전류의 면전에서 단백질을 분리하기 위하여 크기에 의해 이용되는 젤 매트릭스이다. 낮은 백분율 젤은 더 높은 백분율 젤이 더 작은 단백질을 잘 분리하더라도 반면 더 큰 단백질을 분리한다. 문제는 모든 단백질에는 그(것)들로 관련되는 비용이 부과된 있다 이다, 전류에서 이것은 문제를 일으키고다. 이것은 단백질 견본에 SDS의 추가에 의해 해결된다. SDS는 단백질에 각 몇몇 아미노산을 묶고 단백질에는 있는 책임 다름을 중화한다. 이것은 단백질이 크기와 책임으로 아닙니다 분리되는 것을 허용한다.
벽돌 또는 공백 오점 제 시간 포스터는, 그러나 나의 문제를 적합하게 제기하기 위하여 최선을 다할 것이다. 나는 상당량의 계속 서쪽 경험이 있고, 그러나 극복할 수 없습니다… 감마 H2AX 안녕 전부의 탐지! 나는 그(것)들에 DNA 손상을 유도하고 IR를 사용하여 핵에서 감마 H2AX 단백질 (15kDa)를 위해 검출하는 것을 시도하는 신경교종 세포와 AM로 작동하고 있다… 나가 단백질에 의하여 고립시켰다 안정적으로 특정 유전자를 표현하는 포유류 세포 배양에서 총, 핵과 세포질 단백질을 머물렀다. qPCR 분석은 거기 보여주었다 그것을… GFP 항체 어이, 나는 GFP를 서쪽을 위해 1 차적인 antiobody 살 필요가 있는 것을 대략 이고, 누군가가 좋은 것에 관하여 사기 위하여 알고 있는지 생각해 보고 있었다. 감사합니다 선적 통제 계산 나는 나의 WB를 위해 선적 통제로 악틴을 이용하고 있다. 나는 쥐 두뇌를 달리고 있다. 나는 우리와… 관련있지 않는다는 것을 나가 자부한다 악틴에 있는 경미한 변경 본다
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