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윤리학과 과학은 악수한것을 필요로 한다. ~RichardClarkeCabot
또한 보십시요: 외부 사이트에 관계있는 링크: 서쪽 오점
오디오: 상세한 서쪽 오점 설명을
들으십시요! 의례:
국가 인간 게놈 연구소.
서쪽 오점 정의: 서쪽에게 더럽힘것은 명확한 항체에 묶는 그들의 능력에 기초를 두는 단백질을 확인하, 위치하기 위하여 이용되는 기술 이다.
서쪽 오점 분석은 많은 단백질의 혼합물에서 관심사의 너의 단백질을 검출할 수 있는다. 서쪽에게 더럽힘것은 (kDa안에 크기 감적에 비교에 또는 사다리) 너에게 너의 단백질의 크기에 관하여 정보를 제공할 수 있고, 또한 너에게 단백질 표정에 정보를 제공한다 (치료되지 않는 견본 통제에 비교에 또는 다른 세포 유형 또는 직물).
개요: 서쪽 오점은 너에게에 정보를 제공한다:
세포 또는 직물에서, 그러나 또한 시험관내에서 종합되는 재조합형 단백질을 분석한 할 수 있는다 서쪽 오점 분석은 어떤 단백질 견본을 분석할 수 있는다. 특성이 이 단백질을 위해 그것 이는 까 라고 서쪽 오점은 너가 관심사의 너의 단백질을 위해 시험한것을 사용하는 항체의 질에 의존하고. 항체는 지금 쉽게 상업적인 근원에서 획득 가능하, 너는 관심사의 너의 단백질을 위해 1개을 구매할 수 있는다. 너의 단백질이 비발한 단백질 이으면, 너는 항체를 너자신 생성하나 회사를 너를 위해 그것을 하는 얻어야 한다. 의 경우에는 너는 적어도 소량을 세포 추출물에서 순화되나 재조합형으로 한 너의 단백질 필요로 할 것이다 (시험관 내 재조합형 단백질 표정 시스템안에ie). 너의 서쪽 오점에 단백질의 수천의 대신에 관심사의 너의 단백질에 명확하게 묶기 때문에 너의 단백질에 명확한 항체는 서쪽에게 더럽히기에 생명 이다!
숫자 1. 서쪽 오점을 위해 단백질을 얻기안에 관련시키는 단계의 세부사항.
숫자 2. 서쪽 오점을 지휘하기안에 단계를 선발하는 숫자.
[정상]
도표 1을 아래에 보십시요. 첫번째 것 첫번째. 너가 분석하고 싶는 세포 견본 단백질 견본을, 얻으십시요. 단백질 함량을 풀어 놓기 위하여 세포를Lyse. 크기을 기초로 하여 단백질을 분리하는 젤에 이들을 달리십시요. 그때 전기을 사용하여 막의 위에 이 젤 단백질을 옮기십시요. 이 막은 1 차 항체을 사용하여 관심사의 단백질을 위해 시험하기 위하여 그때 사용될 수 있는다.
너가 서쪽 오점을 필요로 하는 무엇이라고:
너의 막과 이전에 너의 젤에 단백질의 수천에서 이 단백질을 검출하기 위하여 서쪽 오점은 1 차 항체에 의지한다! (세포는30,000의 다른 단백질을 포함할 수 있어 - 이 동일한 단백질은 조차 바꾸고300,000의 다른 단백질에 너를!준). 항체을 사용하여 너의 1 차 항체 (이차 항체)을 너가 단백질 항체 항체 샌드위치를 쌓아 올리는 인정한다! 이차 항체에는 가벼운 풀어 놓는 물질으로luminol기질을 개조하는 말 무 과산화 효소 효소가 있는다! 이 빛은 필름에 반점으로 검출된다. 이 반점에서 너는 얼마 단백질이 다른 반점에 관하여 거기서 있는, 또는 젤에 또한 달리는 크기 감적 까에 관하여 단백질의 크기 결정할 수 있는다.
도표 2은 서쪽 오점 보기 젤을 보인다. 차선 1은 단백질의 다른있있던 크기를 보이는 단백질 크기 감적 사다리, 이것 상업적으로 구매될 수 있는다 이고 모든 반점의 크기는 팸플릿안에 준다. 차선 3은 암 견본 이고 차선 5은 정상적인 견본 이다. 너가 볼 수 있는다 대로 차선 3안에 단백질에는 재미있는 차선 5안에 암 견본보다는 더 높은 표정이 있는다. 또한, 차선 3과 5안에 단백질 반점은 같은 차선 1에서 크기 사다리안에 제 2 반점 같은 크기 이다. 우리는 그때 우리가 사다리에 받은 우리의 소책자에서 있있던 단백질 크기를 볼 수 있는다. 단백질의 크기가80kDa이는 것을 우리는 그때 결정한다. 관심사의 우리의 단백질은 또한80kDa이다. 서쪽 오점이 일한 것, 그리고 단백질이 암 견본안에 높게 내색되는 것을 이렇게 우리는 있있다!
너의 단백질을 검출한 위하여:
[정상]
[정상]
서쪽오점을 위해 잘 해내는 순서안에 목차,:
- 서쪽에게 더럽히기를 위해 막에 단백질의Tranfer
- 서쪽 오점
최신 서쪽 오점 화제!
[정상]
-Prepartation을 간색하십시요
- 버퍼를Lysing
- 항체
- 세포를Lysing
- 준비를 교질화하십시요
- 달리는 젤
- 젤의 이동
- 통제
- 서쪽 오점
- 해독
- 분석과 해석
[정상]
너는 무 부착하는 세포 (T 세포 선 또는 주변 혈구같은) 또는 부착하는 세포가 (섬유아세포 세포 또는COS세포같은) 있는다, 너는 매체에서 밖 단백질을 제거한것을 필요로 한다. 무 부착하는 세포를 위해 너는 온후하게 원심 분리에 그들을 산탄, 그때PBS에 펠릿을 세척할 수 있는다. 부착하는 세포, 간단한 세척 플라스크 또는 서쪽 오점보다 전에PBS에 접시를 위해.
서쪽 오점 분석은 단백질을, 시험하고 그래서 우리는 단백질을 세포에서 방출 이고는 그리고 또한 프로테아제에의해 자르기 위로에서 단백질을 막는 원한다. 우리는 서쪽 오점에 이들을 필요로 한다:
- 것을 차 지킨 위하여! 서쪽에게 더럽히기를 위해 세포 세포의 용해동안에 얼음에4C
- 세포의 막을 단백질을 풀어 놓기 위하여 끊 도록 세제를 이용하십시요
- 버퍼
- 우리가 인단백질을 위해 서쪽 오점을 하면) 억제물 (프로테아제 모두 억제물과 인산 가수분해 효소 억제물
제정성 - 서쪽 오점을 위해 세포를Lysing
SDS과RIPA은 서쪽에게 더럽히기을 사용하여 더 늦은 분석을 위해 단백질을solubilize이용하는 세제 이다. 이것은 세포 또는 위치된 안쪽 세포막안쪽에 만큼 많은 단백질이라고 이다 요구된다, 그래서 우리는 그들을 위해immunoblot에 능력 있기 위하여 이 단백질을 풀어 놓는것을 필요로 한다.
[정상]
너는 서쪽 오점을 위해 사용하기 위하여 항체를 선정해야 한다. 흔하게 쥐 단일 클론항체 또는 토끼polyclonal항체는 이용한다.
너는 어떤 추가한 그룹없이 항체를 이용할 수 있는다, 또는 비타민b복합체에 활용시키는 항체를 이용하십시요. 이 항체는 요구하지 않는다
단일 클론항체는 흔하게에 만기가 되는 서쪽에게 더럽히기를 위해 더 낫다:
- 더 나은 신호 대 잡음 비율 (서쪽 오점안에 더 낮은 배경)
- 그들의 더 높은 특이성 (너는 더 적은 오염 단백질 또는Ig을 얻는다)
- 전부 세탁기술자는 서쪽 더럽히는 필름 (검출되는 보다 적게 일반적인 악대)에 유래한다
Polyclonal항체는 Immunoprecipitation을 위해 잘 편리된다:
- 그들은 부연epitopes을 인정한다
- 더 높은 갈망을 있으십시요
[정상]
너의 앞에 끝은 서쪽에게 더럽히기를 위해lyse:
너가 단백질 질량 (iephosphorylated이지 않는) 을 위해 서쪽 오점에 단백질 가면:
- 너는 다른 단백질을 위해 더럽히기 위하여 나머지를 지키는 더 큰 양안에 할 수 있는다 ()lyse
너가 서쪽 오점에 뒤에 오는 것 하는것은 인단백질 가면 (또는phosphorylated단백질) 중요하다:
- 인산 가수분해 효소가 너의 단백질에서 인산염을 제거할 것이기 때문에 너는 사용 인산 가수분해 효소 억제물 확인한다 (v안아dXX어! )
- 너가 너가lysed세포의 최대량을 적재하기 수 있기 때문에 또한 가능한 가장 작은 양안에 세포를lyse(ie은 100개의 을 선적 버퍼, 이것안에 한다lyse. 인단백질을 위해 서쪽에게 더럽힘것이 때 확실히 약해도 중요해도 신호가 이것은.)
너가 단백질 단백질 상호 작용을 보면:
-과 이렇게 단백질이 변성시키는 단백질 단백질 상호 작용을 해리한다 대로SDS을 사용하지 말라 (특별하게 비등다음에)
너는 - 서쪽 더럽히는 단백질 단백질 상호 작용,ie출생지 상호 작용을 위해 - 그런RIPA보다 적게 엄격한 세제를 이용해야 한다.
Lysing:
- 격판덮개 또는 접시에 직접적으로 한 할 수 있는다
- 세포를 산탄
- 얼음과 감기에 유지하십시요 - 얼음 양동이를 이용하십시요
- 얼마 세포의 용해 버퍼 사용함것은 이는 까를 위해 어림셈: 세포의 용해 버퍼의10^5세포/으L
-eppendorf관과 레이블안에 모으십시요 (얼음에 이들을 지키십시요)
서쪽 오점 분석의 앞에 총계 단백질을 측정하십시요:
- 너가 서쪽 오점 분석안에 대우 조건을 비교하고 싶으면 이것은 정량 분석을 허용한다
- 상업적인 장비는 총계 단백질을 측정하기를 위해Bradford분석실험 유효하다 (생물 라드에서)
-SDS또는 더 중대한 깡통의0.1%은 단백질 측량에 방해한다
단백질 견본을 변성시키십시요:
- 세포lysate의 약수에 단백질 선적 견본 버퍼를 추가하십시요 - 염료를 포함한다 (너무 젤,2%SDS에 이동을 보십시요)
- 베타같은 아황산 감소 에이전트를 - 머r잡도XX안올 추가하십시요
- 목욕 또는 난방 구획 (중앙 저온 -안에 헌데90도는 단백질 집단을 줄인다).
- 터진 막 도록 각 관의 모자안에 구멍을 찌르십시요
SDS-PAGE젤은 전류의 면전에서 단백질을 분리하기 위하여 크기에의해 이용하는 젤 모체 이다. 더 높은 백분율 젤이 더 작은 단백질을 잘 분리해도 이지만 낮은 백분율 젤은 더 큰 단백질을 분리한다. 문제는 모든 단백질에는 그들에 연합한 위탁되는 있는다 고 이다, 전류안에 이것은 문제를 일으키고. 이것은 단백질 견본에SDS의 추가에의해 해결된다. SDS에 의하여 단백질에 각 몇몇 아미노산을 묶고 단백질에는 있는 책임 다름이 중화한다. 이것은 단백질을 크기와 아니다 책임에의해 분리하는 둔다.
[정상]
- 얼마의지하고 있는 단백질을 너가 서쪽에게 더럽히기를 위해 적재하고 싶을 것이다 까, 너는 작은 빗 또는 더 큰 빗을 사용해야 한다.
- 아크릴아미드의 백분율은 중요하다. 흔하게10%아크릴아미드는 이용한다.
- 결심 젤은8.8의 pH에 바닥에 이용한다
- 적재다음에 단백질을 안으로 함께 포장하기 위하여 겹쳐 쌓이는 젤 (4-5%) pH6.8은 이용한다
- 젤의 중합은 볼y-XXry람이d어 젤의 중합 반응을 (대형과 응고) 속도를 내는 촉매APS과TEMED에의해 증가한다.
- 각 견본을 주의깊게 느리게 차선에서 새는 견본을 막기 위하여 적재하거든.
- 각 차선을 적재하고 각자안에 견본 버퍼를 이용하십시요 (다름을 안으로 방지한 위하여).
[정상]
- 유리사이 그리고 젤의 밑에 거품을 위해 시계 - 일하고 있는 것을 이것은 의미한다
- 단백질 이동을 위해 시계 (내려갔음 에) - 그렇지 않으면 너는 지도를 전환하고 모든 너의 견본을 잃을 수 있는다!
이것, - 처음에 겹쳐 쌓이는 젤 (~50볼트)을 통해서 느리게 준다 더 예리한 악대를 달리십시요.
- 밤새껏 달리지 말라
- 젤을 과열해 (이것은 젤을 단단함을 잃는 일으키는 원인이 되어,resoloving영세민과 희미한 나쁘게 형성한 악대에 지도한)
[정상]
막 유형을 선정하십시요:
어느 쪽이든을 사용한 할 수 있는다:
- 서쪽 오점을 위해PVDF막
- 서쪽 오점을 위해 니트로셀룰로오스 막
- 지금 사용되는 나일론 막 (희소하게 - 찢는 할 수 있지 않는다)
서쪽 막에Transfering을 위해 끝:
- 장갑을 항상 착용하십시요! 겸자를 사용하십시요
- 막에touching/forceps을 극소화하십시요
생물 라드 이전발주:
(-)
검정에 갯솜
여과지
젤 니트로셀룰로오스
여과지
갯솜
(+)
이동 :
-4C안에 차가운 유지하십시요
-35의V에 밤새껏 옮기십시요
- 더 높은V에 1 시간안에 빠르게 옮긴 할 수 있는다
[정상]
막의 막음것은 너를signal:noise비율을 확대하는 허용한다
- 장갑을 착용하십시요
알부민 - 만취하는5%에 구획 (non-fat분유 - 분말) 또는phosphorylated단백질을 위해 1 -5%BSA(둔감한 혈청).
- 버퍼는TBST이다
막기다음에 세척
- 단계를 막기다음에 세척은 긴요하지 않기, 때문에 1 차 항체 외피동안에 사람 수시로 구획.
- 씻기는TBST버퍼에 흔하게 행해졌. TBST의 큰 양에 빠르게 한 할 수 있는다.
1 차 항체에 외피
- 쥐, 토끼 또는 다른 종
- 흔하게 1: TBST에1000년 희석
- 높은background/many일반적인 악대가 문제 이으면, 외피는5%BSA또는 우유에 끝날 수 있는다.
1 차 항체다음에 세척
- 이렇게 긴요한
-TBST의 큰 양에 빠르게 세척한 할 수 있는다
이차 항체의 외피
- 흔하게 묽게 한 1: TBST에10,000
- 반대로 쥐, 반대로 토끼, 또는 다른 항체는 탐지를 위해HRP효소에 활용시켰다
이차 항체다음에 세척
- 긴요한
-TBST에 5 분을 위해 세척 5X.
- 너가 진짜로 돌진해야 하면,TBST의 더 큰 양에 적어도 3 번을 세척한 위하여.
결과를 위해 분석
- 흔하게ECL(강화된 화학루미네슨스)은 사용된다
- 필름은 드러내고 개발된다. 10 초를 위해 노출은 총계 단백질을 위해 흔하게 충분히 이다. 인단백질은 2개 -20의 작은 노출을 요구할 수 있는다.
- 필름은 흔하게XOMAT또는 유사한'빠른'필름 이다
[정상]
분쟁 해결 서쪽 오점을 보십시요
WB- 서쪽 오점
다른 기간IB-immunoblot(서쪽에게 더럽히기를 위해)
세제SDS- 나트륨Dodecyl황산염 (많은 서쪽 더럽히는 해결책안에 이용하는)
페이지 -Polyacrilamide젤 전기 이동법
Ab- 항체 (관심사의 너의 단백질을 검출하기 위하여 항체는 이용한다)
HRP- 말 무 과산화 효소
Luminol- 가벼운 대형에게 일으키는 원인이 되기 위하여HRP이 쪼개는 기질
서쪽 오점 해결책ECL- 강화된 화학루미네슨스 (가벼운 대형을HRP+Luminol강화하는)
kD/kDa-kilodalton(가장 큰 단백질은30평균한다 -80kDa사이에)
렘 - 토끼 반대로 쥐Ig
Ig-Immunoglobulin(an항체isotype)
NP-40-NonidetP-40
PMSF-phenylmethylsulfonyl불화물
BSA- 둔감한 혈청 알부민
NFDM-Non-fat분유
[정상]
서쪽 후에 항체를
재사용함것은 여보세요
, 우리
이다 가난한 실험실, 실제적으로 나의PI이다
싸.....:kick::hehe더럽힌다: lol은...
나를 모두가 너 서쪽 오점 전문가 너의 1 차를...
재사용하는 까 라고 알는 시키십시요
ubiquitin을 검출하는가
위하여
Ubiquitinated단백질
안녕, 누군가는 항체를 이용하 도록
해보는가 서쪽 오점에 단백질을ubiquitinated?
너가 너의 단백질의 위 악대를의... 보면
1 차 항체가 나
할 수 있는 2개은 1개 견본안에
2 1 차 항체를 동시에 이용한다?
Immunohistochemistry대 서쪽 오점은
누구 나에게 이 2사이 차이를 구별할 수
있었다? 흔하게 사람이 서쪽 오점을 지휘하고에
의하여... 따르는 것과 말하기 위하여 나는
보상한다 이다
젤에서
막에 다른
분자량 단백질 시간의 제일 이동은 이는 무엇
전송 시간? 30k돌턴를 위해
나는1hr을 주고 얻은 결과 지금 결과는... 이다
wesrnblot을 하기
다음에 2개의 악대 나는GATA4
심혼 단백질의 2개의 악대를 왜 얻었다?
그것은 이다 그래서gata4의 실제
중량은50kdalton이고 2개의 악대는의 밑에...
있는다
서쪽 오점에 보이는GAPDH
안녕, 나는 전립선 직물과 그것의
보이는안에GAPDH을 검출한것을 해보고 있다.
다양한Abconcs및 또한 다른 차단제 그러나
아직도 기쁨을....해보지 않았다
문제가
나 아주
평가될 것이다 이는 것을 파악하기 위하여 너가
나를에 인도할 수 있으면, 서쪽 오점 문제
나는 서쪽 오점에 문제가 있는다. 나가...
달릴것을 해볼 때 정상적으로
나가 제 2의
질의
점에서 확실히 지리멸렬할 과거 그것의 것안에
그것을... 할 때restripping막을 위해 최선
프로토콜 어이 나는reprobe에 많은 막을 가지고
있고
귀중한 제 항체의
교차 반응 모두, 나는 좋은 제
항체가 있는다. 있었다 그래서 많은
지정하지 않는 악대는 나의 서쪽 오점 결과
(적어도 3 악대)안에 나타난다. 누군가를
있는다... 한다
[정상]
친구에게 이 페이지를 보내십시요
![[أربيك]](http://www.molecularstation.com/translate/images/flag_ar.gif){kind=small}
