Immunoprecipitation프로토콜

Immunoprecipitation과 프로토콜.

기본적인Immunoprecipitation프로토콜IP:

1. 너의 세포를 대우하십시요

2. 세포를 버퍼를solubilizing의500의 으L을 추가해서 가을걷이하고, 주사통을 통해서21측정한다 균질화하는 바늘X5시간을 긁고 통과하십시요.

3. TCA강수를 지휘하십시요 (이것은 정상화하기 위하여 만약에 방사선 너S-35에 세포 예를들면 이용될 것이다)

4. 전 개간: 전체 견본에X의 2개의 으L을, 쥐 또는 토끼 또는 산양 혈청 (X이 1 차 항체가 올린 동물성 종 이는 까 곳에) 추가해서 전 명확한 그리고 실내 온도에30분을 위해 회전 장치안에 알을품으십시요.

5. 실내 온도에30분 교체에30의 으Limmunoprecipitin에 알을품어서X혈청을 제거하십시요.

6. 13에 3 분,000의 rpm을 위해 견본을 원심 작용을 받게 하십시요.

7. 원심 분리다음에, 곳에Y이 관심사의 너의 단백질을 위해 동물안에 올리는 항체 이는 1 차 항체 (Xanti-Y명확한 단백질)의 5개의 으L을supernatants에 추가하고C4개 도에 밤새껏 알을품으십시요.

8. 견본에immunoprecipitin의 100개의 으L을 추가하십시요. 양자택일로 너는Zysorbin(Invitrogen)을 사용할 수 있는다. (Zysorbin은 프로토콜에 약간 사소한 변화를 요구한다)

9. 13에 분리기, 3 분을 위해000의 rpm. 상청액을 제거하십시요.

10. 각 세척사이5-10분을 위해 동요에 차IP세척 버퍼의 1ml에 펠릿 3X을 (사용보다 전에wah버퍼에 프로테아제 억제물을 추가하십시요) 세척하십시요.

11. SDS-PAGE젤에 달리기 위하여 이 펠릿을 이용하십시요. 너는 이에SDS견본 버퍼 (단백질 선적 버퍼)과 비등다음에 젤에 짐을 수 있는다 직접적으로 추가할.