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너가 여기?"얻은 까 라고Louise-" 쟈니는 "잘, 기본적으로, 거기서 이 작은 점, 권리 이었다? 그리고 점은 강타 가고 강타는 확장했다. 사정, 에너지는 사정, 냉각된 사정으로, 암오amasamat사람을 배치할 것이다 낚시질하고기 위하여, 낚시질하기 위하여, 원숭이에 원숭이에 포유동물에 개구리에 개구리, 포유동물에 가금에 가금에, 형성했다 살았다, 아메바 대상물, 비빈 치즈의 죽음의 상징mori, 영구히, 위에 조금 뿌리,Doomsday까지 석쇠의 밑에 떠나기 위하여." ~From적나라한 영화
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너는 성공적인PCR을 달성하는가의 문제를 있는가? 많은 요인은 너의PCR의 너의 결과를 영향을 미칠 수 있는다: 금속 이온 공동 인자, 기질 및 기질 아날로그, 버퍼 및 소금 및Cosolvents. 또한 열 순환 고려사항: PCR배, 온도와 시간 최적화,PCR확대 주기,Enzyme/Target및 격렬한 출발.
PCR안에DNA폴리메라이제를 위해 근본적인 공동 인자는 마그네슘 염화물 이다. 그것의 농도는 각primer:template시스템을 위해 낙관되어야 한다. 반응의 많은 분대는 뇌관, 템플렛,PCR제품 및dNTPs을 포함하여 마그네슘 이온을, 묶는다. 마그네슘 이온을 위해 주요한1:1결합제는 반응안에dNTPs의 높은 농도 이다. PCR안에 효소 공동 인자로 봉사하기것은 자유로운 마그네슘 이온 필요하기 때문에, 총계 마그네슘 이온 농도는 총계dNTP농도를 초과해야 한다. 전형적으로, 최적화 프로세스를 시작하기 위하여, 염화물1.5밀리미터는 마그네슘0.8밀리미터 총계dNTPs의 면전에서PCR에 추가된다. 이것은DNA폴리메라이제를 위해 자유로운 마그네슘 대략0.7밀리미터 남겨둔다. 장군안에, 마그네슘 이온은0.5밀리미터 단계안에1.54.0밀리미터에서–농도 시리즈안에 변화되어야 한다.
DNA폴리메라이제는 아주 능률적으로dNTPs을 통합한다. PCR안에 추가 분대로 이용할 때, 그들은 또한 변경한 기질을 통합할 수 있는다. DNA폴리메라이제를 위해 이용하는 기질의 보기는 아래와 같는다: Digoxigenin-dUTP, 비타민b복합체11dUTP,dUTP,c7deaza-dGTP, 및fluorescently레테르를 붙인dNTPs. 평범한PCR를 위해, 같은몰 비율, 각dNTP.이 또한 저것을 의 이 표준 권고에서 탈선 μ주의하는 예를들면, 200M안에 균형을 잡는dNTPs유물의 농도는 어느amplications안에 유리할지도 모른다. 예를 들면, 명확한 표적의 무작위 XX아g언엇잇이 원할 때, 균형이 잡히지 않는dNTP농도는DNA폴리메라이제에 의하여misincorporations의 고차를 승진시킨다.
DNA의지하고 있는 폴리메라이제는 최선PCR버퍼 농도, 소금 농도를 사용하고, pH은DNA폴리메라이제에 그러므로 쑤셔야 한다. KCl50밀리미터 및 10 밀리미터Tris-HCl, pH8.3이 실내 온도에TaqDNA폴리메라이제를 위해PCR버퍼에 의하여, 이루어져 있는다. 이 버퍼는 반응동안에 필요로 하는 이온 세기 및 완충능을 제공한다. primer:template쌍신회로의Tm이 소금 농도에 의하여 영향을 미치는 것을 주의하는것은 중요하, 지금부터 어닐링 온도.
PCR확대의 수확량, 효험, 및 특이성을 증가하기 위하여 다른PCRCosolvents은 이용된다. 이cosolvents은 몇몇 확대안에 유리할고, 다른 확대안에 불리할 수 있는다. 어느 첨가물이 각primer:template쌍신회로 및 그런 까닭에cosolvent을 위해 유용할 것이다 까 예언하는것은 불가능하다 실험적으로 각 조합을 위해 시험되어야 한다.
PCR은 효소와 핵산의 낮은 총계에 양립한 좋은 열 이동 특성이 있고 배에는안에 실행되어야 한다. 흔하게, 폴리프로필렌은PCR배를 위해 이용하고 평범한,thick-walledmicrocentrifuge관은 많은 열cycler시스템을 위해 선택된다. PCR은L10 100개 반응 가늠자에– μ수시로 실행되고 열 순환동안에 닫히는 반응 관안에evaporation/condensation프로세스의 예방을 요구한다. 광유 오바레이 또는 왁스 층은 이 목적을 이룬다. 최근에,0.2ml얇은 벽 배는PCR프로세스를 위해 낙관되고 견본 구획안에kacikoiss는 관에 격렬한 덮개를 사용하는oil-free열cyclers은 디자인되었다.
각 열 주기안에 변성, 어닐링, 및 연장 온도가 반응 혼합물에 의하여 도달한다 고 근본적 이다. 부족한 대기 시간이 어떤 온도에 지정되면, 견본의 온도는 견본 구획의 저것에 평형시키지 않을 것이다. 다른 사람이 예언한 견본 온도에 대기 시간을 기초를 둬도 이지만, 약간 열cycler은 파악 간격이 구획 온도에 기초를 둔 시간을 디자인한다. 구획 온도에의해 통제되는cycler안에 사용되는 평범한thick-walled관이,60-s대기 시간 평형을 위해 충분하면. 더 긴PCR제품을 위해 여분의 시간은 (72캜) 연장 단계에 추천될 수 있는다. 예언된 견본 온도에의해 통제되는cycler안에 얇은 벽0.2ml관을 사용하여, 단15s은 요구된다. 다각 실험실에 사용을 위해 발달 프로토콜에 기존하는 프로토콜을 또는 사용하기 위하여는,cycler디자인과 관 벽 간격에 따르면 대기 시간을 선택하는것은 아주 중요하다.
PCR확대 주기의 수는 표적DNA의 시작 농도에 관하여 낙관되어야 한다. 동일한 농도에 3개의105의 분자를– 증폭하기 위하여50의 표적 분자를 증폭하라고40의45주기–, 및25의30주기 × 에서 고, 추천된다. 이 무 비례는 제품 축적의 지수 비율안에 감소가PCR의 후기안에 일어나는 소위 고원 효력에의해 일으키는 원인이 된다. 이것은 반응물 (dNTPs, 효소)의 강직에의해 일으키는 원인이 될 수 있는다; 반응물 소모 (뇌관,dNTPs); 최종 생산물 금지 (파이로인산 대형); 일반적인 제품에 의하여 반응물을 위해 경쟁; 또는 집중된 (10 nM) 제품의reannealing서 묶는 뇌관을 위해 경쟁. 주기의 수가 과량 이으면 일반적인 제품이 방해할 것이기 때문에, 흔하게 원한 명확한 제품을 보기 위하여 필요로 하는 주기의 최소 숫자를 달리는것은 적당하다.
L100개 반응을 위해 이용하는TaqDNA폴리메라이제의 표준μ약수안에, 대략1010의 분자 있는다. 각PCR견본은 포함하나 포함할 수 있는 표적 사본의 수를 위해 평가되어야 한다. 예를 들면, 람bd아DNA의 1개ng은1.8107의 × 사본을 포함한다. 낮 입력 사본 수PCR를 위해, 효소는 제한할 것이다 되고 연장 프로세스에게 증대로 부연 시간을 주는것은 필요할지도 모른다. PCR수확량을 확대하기 위하여 열cyclers은 견실하게 이 자동 세그먼트 연장 절차를 실행할 수 있는다.
상기 최적화의 모두는, 격렬한 출발 방법에 처음에서, 디자인되는PCR에 또한 적용한다. 수시로, 격렬한 출발은 반응 조건을 변화하기없이 이전에 낙관한PCR으로 성공적으로 통합될 수 있는다. 그런데, 그것은 격렬한 출발을 추가하기다음에 흔하게reoptimize지불한다. 최적화는 가능한것과 같이 수시로 만큼 다량 제품을 생성하고기, 배경 확대사이 균형 일반 과잉 생산 이다. 격렬한 출발이 중대하게 배경 확대를 감소하기 때문에, 위 감금은 효소 농도, 주기 수, 및 금속 이온 공동 인자 농도같은 조건에 올린다. 격렬한 출발이 추가될 때 격렬한 출발없이 높게 조정된 과민한PCRs은 실패할 수 있는다. 이것은 섞기 효소 활성화에의해 일으키는 원인이 되는 이른 주기안에 경미한 지연에의해 일으키는 원인이 될 수 있는다. PCR은 명확한 제품안에 내용이 풍부한 증가에 간단하게 증가해서 흔하게, 수시로, 복구될 수 있어 매개변수 또는 시약을 제한한. 더하여, 각 격렬한 출발 방법에 명확한 최적화 있는다. 섞으나 효소 활성화는PCR양, 버퍼 구성 및 pH 의cosolvents, 순환 조건에의해, 그리고 이렇게 위에 영향을 미칠 수 있는다. 명확한 제품’s 문학, 수시로 제품 삽입은 이 고려사항에 정보를 위해, 상담되어야 한다.
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