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PCR장비와 제품

폴리메라이제 연쇄 반응 (PCR)의 역사 그리고 발달

또한 방문 PCR 역

저작권2006년MolecularStation

폴리메라이제 연쇄 반응 -PCR

PCR에 소개 - 폴리메라이제 연쇄 반응

폴리메라이제 연쇄 반응 (PCR)

PCR의 발견될 것이다 개념

PCR의 강령

Polymerases/Reaction특이성과 능률

PCR의 공용품

PCR과 분자 클로닝

Misincorporation: 시험관 내 시스템 의 과실

반응 특이성

클로닝 방법으로PCR의 중요한 이점은 그것의 속도, 감도, 및 강건함을 포함한다

PCR의 제한

PCR을 위해 계기

Oligonucleotide종합

뇌관 디자인

오늘의PCR

PCR은 이제까지 대체될 것인가? – helicase의존하는 확대 (HDA)

PCR에 소개 - 폴리메라이제 연쇄 반응

생물학을 위해 공구가 생활의 학문을 혁명을 일으켰다 대로30년 이상전에, 재조합형DNA기술의 소개. 분자 클로닝은 살아있는 유기체의 개인적인 유전자의 학문을 허용했다; 그런데 이 기술은 청정한DNA의 관계되 대량을 얻기에 의존했다. 이것은 미생물의 세포 분열동안에 플라스미드 다른 선그림의DNA의 복제에 (1) 의존했다. 연구원은 그것을 극단적으로 힘들고 그리고 생물학 견본 (2)안에 현재 유전자의 질량에서 양안에 명확한DNA을 얻게 곤란하다 발견했다. 재조합형DNA기술은 몇 인간 질병의 첫번째 분자 분석 및 태아기 진단을 가능하게 했다. 양수천자 표본 추출에의해 얻는 태아DNA은 복제한 유전자 올이g온읒러XX이d어 조사에 금지 효소 소화, 전기 이동법, 남쪽 이동 및 교잡에의해 (3) 분석될 수 있었다. 그런데, 남쪽에게 더럽힘것은 비관련 개인안에 유전자의 단 기초에게 지도로 나타내기 (4) 허가했다.

폴리메라이제 연쇄 반응 (PCR)

PCR의 폴리메라이제 연쇄 반응 (5,6)을 위해 약어는, 대량의 생산에게 간단한 효소 반응안에 복잡한DNA템플렛에서 명확한DNA을 주었다. PCR은DNA의 시험관 내 확대를 위해 최근에 개발한 절차 이다. PCR은 거의 모두가 의 결과로DNA파편의 조작을 요구하기 실행될 수 있는 그것의 간명 및 유용성 (7) 공부하는 방법을 변형시켰다.
숫자 1)과CetusCorporation에CetusCorporation에 연구원의 팀은 1980년대안에,KaryMullis(DNA의 단일 나선에 따라서 명확한 점에 폴리메라이제 활동을 시작하, 멈추는 방법의 생각했다. 분자 재생산 기술의 이 분대를 마구를 채워서, 표적DNA이 지수로 증폭될 것 을 수 있은 것을Mullis은 또한 실현했다. 이DNA확대 절차는 시험관 내 오히려 생체 조건 프로세스 (5,6,8)에 기초를 뒀다. 분석하는 클로닝을 위해 표준 절차, 및 변경 핵산의 많은 것을 간단하게 했PCR에의한Cell-freeDNA확대는 (1). DNA의 명확한 조각을 고립시키기를 위해 이전 기술은 지루하고 느린 – 절차를 복제하는 유전자에 의지했다. 너가 원하는 때PCR은, 이와 반대로 “진술되는KerryMullis너는DNA의 조각을’흥미있는다시 너 안으로 쑤시, 그것의 그와같이 있는 시킨다” (2,8). 폴리메라이제에게 연쇄 반응을 하기안에 계승할Cetus다른 과학자가 실행할 최후에 견실한 유행안에 원할대로 때, 그들은 근본적으로 그들의 일 (8)을 위해 요구된 정확한 유전 물질 분자 생물학자 및 다른 사람 의 무제한 양을 제공하기를 위해 굉대하게 강력한 기술이 있었다. 첫번째 보고in1985부터,5000과학 종이 이상은1992년 (1)에의해 간행되었다. 게다가, 다수 간행물에 의하여 당연히PCR기술의 발달 그리고 응용에 모든 중요한 기여금을 검토한 것을 불가능한 한다; 그런데 우리는 여기 기본적인PCR의 연습안에 가장 중요할 발달을 검토한것을 시도할 것이다.

PCR의 발견될 것이다 개념

Emeryville, 캘리포니아안에CetusCorporation에 일하고 있는 동안PCR은1983안에 박사KerryMullis에의해 생각되고 생각했다. 그런데 2개의 뇌관을 사용하여DNA의 조각을 복제하기의 근본 원리를 기술한 까 누구가, 약간 개척1971년에GobindKhorana에의해 또한 일되었다. 진도는 뇌관 종합과 폴리메라이제 정화 문제점에의해 그때 (9) 제한되었다. Mulliss’머리안에, 진단 일반적인 인간 질병 돌연변이을 위해 합성 올이g온읒러XX이d엇을 사용하여 유일한 인간 유전자의 한정되는dideoxynucleotide연속을 실행하기 위하여 발명품은 이론 계획에서 성장했다. 그런 직접적인 연속 전략에 명백한 장애는 인간 게놈 (3.3X109쌍)의 높은 복합성 이었다. 따라서 첫번째 뇌관의 종합의 진행성을 막기 위하여, 제 2 올이g온읒러XX이d어 또는 뇌관은 추가되었다. 돌연변이체 대립 유전자의 각 물가가 최후 신호에 공헌할텐데 하기 위하여, 늦게 그런데, 이 제 2 뇌관은 다른DNA물가에 묶기 위하여 포함되었다. 각 물가에 뇌관의 동시 교잡을 관련시키는 계획이 혼합물을 가열하고기 그때 어닐링 및 연장 단계를 반복해서 변경되면, 그때 1 차 신호는 증가한 조차 더 이을텐데. 2개의 사본을 열매를 산출하기 위하여 단계를 반복함것은 첫번째 원의 제품을, 제 2 주기안에 중복되는 가능하게 할텐데. 주기를 반복함것은 4개의 사본,등등cetera안에 다시 유래할텐데. 이 좋은 아이디어가 (8) 시도될 전에 몇 주는 통과했다. 2개의 뇌관은 인간b-globin유전자의 복제한 세그먼트의110의 쌍 지구의 각 말에 완전하게 무료하기 위하여 종합되었다, 확대는 실행되고, 제품은 아크릴아미드 젤 전기 이동법에의해 확인되었다. 최종 결과는 분자 생물학 (5,6)안에 기본적인 기술으로PCR의 예기한110의 쌍DNA파편 그리고 처음 이었다.
Mullis's원래PCRprocess(5,6,8)안에, 효소는 시험관내에서 이용했다 (유기체이상으로 제어 환경안에). double-strandedDNA은 2개의 단일 나선으로96캜에 그것을 가열해서 분리했다. 이 온도에, 효소가 각 주기 의 난방 단계다음에 보충되어야 했다 하기 위하여 그런데,E.ColiDNA폴리메라이제는 파괴되었다. dna폴리메라이제의 많은 시간, 광막한 총계, 및PCR프로세스를 통하여 연속적인 주의를 요구했기 때문에Mullis's원래PCR프로세스는 아주 효과 없었다.

PCR의 강령

PCR확대 기계장치의 검사는 그것의 간명 그러나 또한 그것의 우아 (숫자 2)을 계시한다. Oligonucleotide뇌관은 증폭하, 그때DNA템플렛에 어금니 과잉 섞는 순서의 말에 무료하기 위하여 첫째로 및 적당한 버퍼안에deoxyribonucleotides안에 디자인된다. 고유 물가 및 뇌관 어닐링, 올이g온읒러XX이d엇을 승진시키기 위하여 냉각을 변성시키는 따르는 난방 표적 파편의 다른 물가에 각 묶는 것. 각자가DNA폴리메라이제의 활동에의해 연장할 때, 새롭게 종합한 물가가 반대 올이g온읒러XX이d어의 의무 사이트를 부분적으로 덮을 것이다 하기 위하여 뇌관은 둔다. 변성, 어닐링, 및 폴리메라이제 연장의 프로세스가 계속되는 때 뇌관은 새롭게 종합한 물가안에 원래DNA템플렛 그리고 무료한 사이트 모두에 반복적으로 묶고DNA(숫자 3)의 새로운 사본을 일으키기 위하여 늘인다. 최종 결과는 곳에n이 주기 (1,7,13)의 수 이는,2n의 이론 풍부에 마지막으로 대표되는,PCR뇌관사이 순서를 포함하는DNA파편의 총계안에 지수 증가 이다.

Polymerases/Reaction특이성과 능률

DNA 폴리메라이제는 자연적 사건 효소,DNA의 대형 그리고 수선을 촉매 작용을 미치는 생물학 고분자 이다. 그것은 단순한DNA물가에 묶고기 무료한 물가를 만들어서 일한다. 모든 살아있는 사정의 정확한 복제는 세포가 분할할 때 곳에DNA을 중복하기 위하여 작용하는 이 활동에 의존한다, (10,11). 단 최근에 과학자를 이 활동을 교묘히 다루, 과학적인 연구에 적용한것을 배우십시요. 인간genomicDNA(5,6)에서 명확한 표적을 증폭하기 위하여 가장 이른PCR실험은37C의 온도에 대장균DNA폴리메라이제i의Klenow파편을utlilized. 수시로 젤 전기 이동법 (1)에의해 재판되는것과 같이 불완전하게 청정한 표적 제품이 이PCR반응에 의하여 생성했다. Klenow파편에 이 처음PCR확대는 높게 명확하지 않았다 (5,6). 유일한DNA파편이genomicDNA에서 증폭한~200,000겹 이어 수 있었,PCR제품의 대략1%이 표적으로 한 순서 (13) 이었다 다만. 명확한 교잡 조사는 증폭된DNA(5,6)을 분석할것을 요구되었다.
더 낮은MgCl2농도 및 더 높은 어닐링 온도같은 뇌관 교잡의 엄중을 증가하기 위하여 몇몇PCR상태는 결정되었다.
게다가PCR의 특이성을 초래하기 위하여, 효소와 뇌관의 농도,PCR의 어닐링 시간, 연장 시간, 및 수는 모두를 발견되었다 순환한다.
또한, 견본안에 명확한 순서의 농도는 또한PCR제품 (1,7,13,14,15)의 관계되는 균질성을 좌우할 수 있는다. 적당한 버퍼안에Deoxyribonucleotide3인산염 그리고 마그네슘은PCR을 위해 또한 중요한 성분 이다. PCRs의 능률 그리고 특이성은 자유로운 마그네슘,deoxyribonucleotide3인산염, 및 뇌관의 농도 그리고 비율안에 변이에의해 영향을 미칠 수 있는다. 높은 특이성을 달성하, 열매를 산출하기 위하여 이 시약은 낙관되어야 한다 (14). 폴리메라이제 연쇄 반응 (15)에의해 또한 고 특이성에 온도 그리고 올이g온읒러XX이d어 뇌관 길이의 효력 및 확대의 능률 발견되었다.
물가 별거를 위해 요구된 고열에 대장균DNA폴리메라이제i의Klenow파편의 비활성화는 각 주기 (5,6)의 변성 단계다음에 효소의 추가를 요구했다. 1988년보다 전에,PCR반응 절차를 지휘하는 누군가는 일련의 근해 목욕 또는 가열 구획에의해 참을성이 있 앉,½을 위해 끓는 물안에 반응 배를 가라앉혀서 전형적으로 실행된 각 변성 단계다음에E.ColiDNA폴리메라이제의 신선한 약수를 추가하기 위하여 은혜를 베풀었다,; 분에 3 분 (7). 이 오히려 지루한 단계는thermostableDNA폴리메라이제,PCR반응의 처음에 TaqDNA폴리메라이제 (12)의 소개에의해 한 번, 삭제되었다. 전면110C의 간헐천안에 성장하는DNA폴리메라이제 활동의thermostable재산은Thermusaquaticus(Taq)에서 고립시켰다 (숫자 폴리메라이제 연쇄 반응 (1,7,12공헌하고)의 수확량, 특이성, 자동화, 및 공용품에 4)은, 중대하게.   Taq 효소는94C에 반복한 난방을 저항할 수 있고 올이g온읒러XX이d어 뇌관을 묶을 허용하 도록 혼합물이 냉각될 때마다 이렇게 연장을 위해 촉매는 이미 출석한다 (1,7). 그런데, 더 높은 어닐링 온도는PCR발달 (8), 박테리아Thermus “thermophilicaquaticus(Taq)” 에서 방열DNA폴리메라이제의 정화 및 상업적인 배급의 단순한 가장 중요한 발달까지 (12) 설치하지 않았다.
그것으로 감소하는 올린 온도nontarget순서 (일반적인 확대) 또는 증가 특이성에 (1,7,12,13)에, 실행될 것이다 방열DNA폴리메라이제 또한 허용한 뇌관 어닐링 및 연장의 격리는 어닐링을 짝을 잘못 졌다.   이 방법, 왜냐하면 많은 확대안에PCR제품은 전기 이동 젤 (12)에 단순한 XX이d이음에 의하여 평범한 사람 얼룩이 진 악대로 검출될 수 있었다. 이 증가한 특이성은 또한 표적 순서의DNA수확량을 증가했다. 더욱, 더 긴PCR제품은 뇌관 연장을 위해 사용된 올린 온도에 템플렛 물가의 이차 구조안에 감소에 만기가 된genomicDNA에서, 가능하게 증폭될 수 있었다. Klenow파편 폴리메라이제 확대를 위해 위 크기 한계는400bp에 관하여 단 이었다. Taq폴리메라이제와 다른thermostable폴리메라이제는 파편 10 종사하고 킬로 비트 종합했다 (1,7,12,13)을. 매우 더 쉬운 업무 그냥Taq다를 온도로 반응 관을보다는 효소 약수의thermocycling그리고 추가를 모두 실행할텐데 장치를 제조하기 위하여 순환할 것이다 기구를 건설하는 폴리메라이제의 가용도는 또한 중대하게 반응의 자동화를 간단하게 했다. 현재 유효한thermocyclers의 중대한 다양성 상업적으로 있는다. 이 발달은 과학계에의해 이 기술의 급속한 응용안에 뜻깊은 요인 계속 (7) 이다.

PCR의 공용품

PCR에의해 형성될 수 있는double-stranded, 무뚝뚝하 끝낸DNA파편의 생산에 더하여,PCR의 2개의 다른 특징은PCR의 공용품에 공헌한다 중대하게 계획한다. 첫째로, 뇌관의 바인딩의 위치는 증폭한 파편의 경계를 정의하고 그런 까닭에 금지 언d온읒러앗어 인식 부위의 전 분자 클로닝 필요조건은PCR을 위해 요구하지 않는다. DNA순서의 단 한정되는 수가 금지 사이트 이기 때문에,PCR은 중대하게 파편 크기와 구성의 선택의 융통성을 증가한다. 엄정하게 템플렛DNA에 무료한 둘째로,PCR올이g온읒러XX이d엇 필요하지 않다. “” 증폭한DNA으로 돌연변이같은 금지’ 언d온읒러앗어 인식 부위 또는 다른 유용한 순서를 도입하기 위하여 이렇게 개발될 수 있는 프라이밍 사이트안에 순서를 도입하기 위하여 꼬리는 뇌관의 5 끝에 추가될 수 있는다. 이 현상은 급속한DNA클로닝 (1,7,13)을 위해 방법으로PCR의 출현을 허용했다.

PCR과 분자 클로닝

분자 클로닝은 기술으로PCR의 출현에게서 혜탁받았다. 직접적인 클로닝은PCR이 증폭한110의 bpDNA파편을 사용하여 첫째로 지휘되고 포함한 올이g온읒러XX이d어 뇌관은 그들의 5개의 끝에 금지 언d온읒러앗어 인식 부위’ 추가했다. M13플라스미드로 증폭된DNA의 클로닝을 이용했다 (17) 촉진하기 위하여 이 사이트는. 이 접근이 클로닝에 급속하고 그러나 견실한 접근 이던 것을 확인하기 위하여110의 bp 파편은 또한 연속. (숫자 5)

**Misincorporation: 시험관 내 시스템 의 과실**

Cell-basedDNA클로닝은 기계장치를 교정하기 때문에 베끼기 의 아주 고충실도에 회합되는DNA복제를in-vivo관련시킨다. 그런데,DNA이PCR에것과 같이 시험관내에서 복제할 때, 베끼는 오류율은 상당하게 더 중대하다. 널리 쓴 폴리메라이제, Taq DNA폴리메라이제에는 그런데, 교정 기능 수여할 것이다’연합한’ 3 에 5exonuclease이 있지 않는다. 따라서DNA복제동안에misincorporation에 만기가 되는 오류율은Taq을 위해 오히려 높다 : 이중의20의 효과적인 주기를 겪은 이 효소을 사용하여PCR이 종합한 킬로 비트 순서 1개를 위해, 새로운DNA물가의 대략40%은 부정확한 뉴클레오티드를 포함해 베끼는 과실 (16)에서 유래한. 그런 까닭에,PCR반응이 단순한DNA순서의 확대를 관련시키면 비록, 완성품은 거의 일치의 혼합물, 그러나 동일할DNA순서 이을 것이다. 복제에 만기가 되는 과실에도 불구하고 시험관내에서, 총계PCR제품의DNA연속은 부정확한 기초의 합동이 근본적으로 무작위 이고 한개 이상 물가에 1개의 부정확한 기초의 기여금이 정확할 순서가 있을 것이다 물가에는의 거대한 대다수에게서 기여금에의해 압도한다 고 사실에 만기가 되는 정확한 순서를 줄 수 있는다. 그런데,PCR제품이 세포안에 복제한것을 이으면, 지휘 더 실험보다 전에 정확한 (일치) 순서를, 결정하기 위하여 몇 개인적인 복제품은 연속 필요로 할 수 있는다.
최근에,PCR반응동안에DNA복제의 불신앙의 문제는 3 에 5exonuclease활동을 회합한 양자택일heat-stableDNA폴리메라이제를 사용해서’ ’ 상당하게 감소했다. (환풍 )Pyrococcusfuriosus(Pfu) DNA폴리메라이제 와ThermococcusLitoralis은 그들의 연합한 3 에 5exonuclease활동 (18)에의해 수여되는’ 교정때문에’ 널리 썼다 되고 있다. Pfu의 유래 예컨대의PCR제품에는, 과실을 베껴서 도입되는 돌연변이의 다량 저수준이 있는다: 이중의20의 효과적인 주기를 겪은DNA의 킬로 비트 세그먼트 1개를 위해,DNA의 대략3.5%은 제품안에 나른다 바꾼 기초 (16)을 배가 좌초한다.

반응 특이성

TaqDNA폴리메라이제가DNA종합을 위해 최적 조건의 밑에 온도에 상당한 효소 활동을 잘 유지한다 고 특이성을 개량하는 새로운 접근은 승인에 기초를 뒀다 개발되었다. 따라서 명확하게 단련하는 뇌관의 연장을 위해72캜이 반응에 의하여 도달할 전에, 부분적으로 단순한 배가 좌초한 템플렛 지구에non-specifically단련하는 뇌관은 장시간 이을 수 있는다. 높은 (>70캜) 온도가 반응에 의하여 도달할 직후에DNA폴리메라이제가 활성화되면, 무 표적 확대는 극소화될 수 있는다 (19,20). 이 “격렬한 출발” 접근은 올린 온도에 선택 관에 근본적인 시약의 손으로 하는 추가에의해 달성될 수 있는다. 명확한 확대를 증가하라고ssDNA의무적인 단백질의 추가는 또한 보고되었다. 더 사용하기 쉬운 접근은DNA폴리메라이제의 금지 또는 비활성화 자체를 사용하기 위하여 이다. TaqDNA폴리메라이제의 금지의 2개의 유형은 올이g온읒러XX이d어 금지 (21)과 항체 (22) 금지를 포함하여 해봤다. 양쪽TaqDNA폴리메라이제의 높게 명확한 올이g온읒러XX이d어 억제물은 생성했다. 이들은40캜의 밑에 온도에 선택으로DNA폴리메라이제 활동을 금하고 기능에게 격렬한 출발 응용안에 보였다. 양자택일로, 1개은TaqDNA폴리메라이제향하여 항체를 이용할 수 있는다. 항체는 그것으로 효소를 풀어 놓는 온도 보다 큰55캜에, 변성시킨다 고PCR의 온도가 그런 이을 까지 항체는DNA폴리메라이제를 금한다. 아무리 격렬한 출발 상태의 이 유형에 불리 있는다. 의 경우에는, 1개은PCR안에 이용하는 각 다른 효소를 위해 항체를 필요로 하고 많은PCRs을 위해 이것은 비용 뜻깊게 일어날 수 있는다. 실내 온도 (온도 과민한 돌연변이체)에 비활동성 이다 그런 방법으로 격렬한 출발의 가장 편리한 양식은DNA폴리메라이제를 변경한것을 이고,6-15분 (23)을 위해95캜에 외피다음 단 재가동된다.

클로닝 방법으로PCR의 중요한 이점은 그것의 속도, 감도, 및 강건함을 포함한다

그것의 간명때문에,PCR은 넓은 채용 범위에 대중적인 기술 이다
직접 순서,genomic클로닝, 전염하는 미생물의 탐지 타자를 치는,DNA방법의 근본적으로 3개의 중요한 이점에 의존하는 대립 형질 순서 변이의 사이트 지시된 XX아g언엇잇, 태아기 유전자 질환 연구, 그리고 분석를 포함하여 (1,7,13,16의):

속도와 어앗어-오f-읏어: PCR에의한DNA클로닝은 약간 시간안에 소요 시간 관계되 짧은안에, 실행될 수 있는다. 흔하게, 주변에30주기가PCR반응에 의하여 변성, 종합을 포함하고 자동화한 열cycler안에 전형적으로 3개의 5 분을 걸리는 개인적인 주기에 단계를,reannealing각 주기 이루어져 있는다. 이것은 명확하게 시간의 주를 걸릴 수 있은cell-basedDNA클로닝을 위해 요구되는 시간보다는 더 빠르다. PCR반응을 설치하는것은 게다가, 확실히 쉽thermocycler기계의 사용은 또한 쉽다. 언젠가는 올이g온읒러XX이d어 뇌관의 디자인 그리고 종합을 위해 요구된다, 그러나 이것은 뇌관 디자인을 위해 컴퓨터 소프트웨어의 가용도 및 주문 올이g온읒러XX이d엇의 급속한 상업 학문적인 종합에의해 간단하게 했다. PCR상태의 최적화는 뇌관 어닐링 온도, 마그네슘 농도, 및 뇌관 농도같은 요구될 수 있는다. 그런데, 다양한 뇌관 어닐링 온도를 동시에 시험되는 두는 기온변화도PCR기계의 창조는 중대하게 이 단계를 위해 요구되는 시간을 줄였다. 한 번 반응을 위해 최선 조건은, 계속 반응 간단하게 반복될 수 있는다 그때 얻는다 (1,7,13,16).

감도: PCR은 표적DNA의 정확한 총계에서 순서, 단세포 (24)에서 조차DNA을 증폭하기의 가능하다. 그런 절묘한 감도는 분자 병인을 공부하기의 새로운 방법을 주고 법정 과학, 진단, 타자를 치는 단순하 정액을 사용하여 유전 결합 분석 및 곳에 견본이 세포의 작은 수를 포함할 수 있는 분자 고생물학 학문안에 수많은 응용을 발견했다. 그런데 수사의 밑에 견본의 오염을 기피하기 위하여 신중이 어x더r날DNA에의해 가지고 가야 하는 것을, 방법의 극단적인 감도는, 의미한다 통신수 (1,7,13,16)에게서 세포의 정확한 총계에서같은.

강건함: 핵산 근원의 넓은 범위는PCR확대를 위해 적당한 템플렛 이다. 각종 종에서 순화된DNAs및 근원은 증폭되었다. PCR은DNA이 평범한DNA격리가 문제 이는 매체안에 나쁘게 타락되나 끼워넣는 물자에서 명확한 순서의 확대를 허가할 수 있는다. 그 결과로, 다시 분자 인류학을 위해 아주 적당하 고생물학은, 고고학 유물에서 재기되는DNA의 예를 들면 분석 공부한다. 포르말린 조정에서DNA을 증폭하기 위하여 그것은 또한 성공적으로 이용되었다 또는 파라핀 끼워넣은 조직 추출은 분자 병리 및 있는, 어떠한 경우에는, 유전 결합에는안에 중요한 응용이 공부한다. 표적 파편이 관계되 풍부하 때 일반적으로,PCR확대의 성공은 가장 중대하다 (1,7,13,16).

PCR의 제한

그것의 거대한 인기에도 불구하고,PCR에는 선택으로 명확한DNA순서를 복제하기를 위해 방법으로 어느 제한이 있는다.
특별한DNA순서의 선택 확대를 허가하는 명확한 올이g온읒러XX이d어 뇌관을 건설하기 위하여, 약간 전 순서 정보는 흔하게 필요하다. 관심사의DNA지구가 분할 이전에 성격을 나타낸 것을 이것은 정상적으로, 수시로 뒤에 오는 전cell-basedDNA클로닝 의미한다. 그런데, 표적DNA에 관하여 전DNA순서 정보를 위해 필요를 감소하고또는 제하는 다양한 접근은 개발되었다. 유전자의 일원 또는 그의 일원의 이전에 성격을 나타낸 반복적인DNA가족 적어도 것 이으면 이전에uncharacterizedDNA순서는 퇴화하는 올이g온읒러XX이d엇에PCR을 사용하여 때때로 복제할 수 있는다. extemely한정되는 양안에 출석하는DNA의 근원에서DNA순서의indiscriminateamplification을 허가하기 위하여 어떠한 경우에는,PCR은 표적DNA에 관하여 어떤 전 순서 정보없이 효과적으로 이용될 수 있는다. 그런 까닭에, 전체 게놈 확대를 지키기 위하여PCR은 적용되어 수 있어도,genomicDNA도서관을 함유하는 개인적인DNA복제품을 분리하기의 방법을 제안하기안에cell-basedDNA클로닝의 이점이 있지 않는다.
곳에 세포 배양의 양의 오르십시요 위로cell-based클로닝을 사용하여 얻을 수 있는 총계가 가능하다보다는 매우 제한해 단순한 반응안에 얻는PCR제품의 총계는 또한 이다. PCR반응의 능률은에서 템플렛 그리고 반응을 낙관할것을 요구되는 그러나 제품의 전형적으로 단 비교로 적은 양이 달성되는 각종 요인에 따르면에 템플렛 변화할 것이다.
PCR의 이론 생산이 지수 이어도, 계획이 그것의 최대 잠재력보다는 더 적은에 운영하고 있는 것을PCR의 실제 이윤율은 매우 보다 적게 지적하고 있다. 예를 들면, 각 주기에 제품의 총계는 최후에 떨어져 수평하게 한다. 이 고원은 뒤에 오는 현상에의해 설명될 수 있는다. 첫째로, 템플렛의 어떤은 정화와 처음thermocycles동안에 다른 고분자에서 해리하는에 결코DNA의 물가 틈 또는 실패에 유효한 만기가 될 지도 모른다. 둘째로, 효소의 총계는 유한 이고 최후에 활동은 줄일 수 있는다. 상부가double-stranded제품의 농도에 의하여 도달하기 때문에 셋째로, 경쟁은 템플렛 (PCR제품)의 어닐링과 무료한 템플렛 물가 (1,7,13)의reannealing사이에 뇌관에 증가한다.
DNA클로닝 방법으로PCR의 명백한과 많은 시간 중대한 불리는 복제할 수 있는 계속DNA순서의 크기 범위 이다. 곳에 복제한DNA순서의 크기가 2 메가비트에 접근할 수 있는PCR이 복제하는DNA순서를 보고되는cell-basedDNA클로닝과는 다른 전형적으로 이 가늠자의밑바닥에0.15개 킬로 비트 크기 범위안에, 수시로 있었다. 원하는 제품 길이가 증가하는 때 점점 곤란하게 된다 그런데,DNA의 작은 파편은 능률적인 확대를 얻는것은PCR에의해 흔하게 쉽게 증폭될 수 있는다. Barnes은DNA의PCR확대에 (25) 표적 길이 제한을 인정했다. 그는 고충실도 긴PCR을 지휘하기 위하여3'-exonuclease활동 (Pfu, 환풍, 또는 깊은 환풍)을 전시하는thermostableDNA폴리메라이제의 아주 저급에exonuclease자유로웠던 것의 상부,TaqDNA폴리메라이제,Klentaq1의n맨끝 삭제 돌연변이체의 조합을, 사용했다. 살균소 람bd아의 적어도35킬로 비트는 람bd아DNA템플렛의 1개ng에서 높은 수확량에 증폭될 수 있는다. 뇌관으로PCR제품을 이용하는 이 방법의 사용은 증가한 기초 쌍 절조, 능력, 및 표적 파편의 최대 수확량을 열매를 산출했다. 다른 조건은phaga람bd아DNA(26)에서 인간genomicDNA에서 베타globin유전자 다발의22종사하고 킬로 비트의 확대를 포함하여 더 긴 표적의 효과적인 확대를 위해, 및42종사하고 킬로 비트 확인되었다. 이 긴PCRs에 의하여 포함된 증가한 pH 의 추가와 글리세롤의 디메틸슬폭시화물(dmso)을 위해 조건은, 연장5'-exonuclease3'에a을 소유하는 이차thermostableDNA폴리메라이제, 또는 "교정의 시간 증가한, 그리고 사용 변성 시간을," 활동 줄였다. "긴PCR" 프로토콜은 명확한 뇌관 어닐링을 위해 폴리메라이제의 저급 및 온도와 소금 상태를 사용해서genomicDNA안에 표적을 위해 요구된 특이성을 유지했다. 10-40킬로 비트의DNA순서를 증폭하는 능력은genomic지도로 나타내고기 연속에게PCR의 속도 그리고 간명을 가져오고 분자 유전학 (26)안에 학문을 촉진할 것이다. 일반적으로, 장거리PCR을 위해 조건은 2 폴리메라이제 시스템에 표준 상태에 수정의 조합을 관련시킨다. 이것은 교정 기계장치 (16)으로’봉사하는DNA’ 폴리메라이제와 3 에 5exonuclease활동의 최선 수준을 제공한다.

PCR을 위해 계기

Thermocyclers은1986년에 자동으로 통제하는PCR순환을 위해 온도 도입되었다 (숫자 6). PCR시약안에 전진에 더하여, 순환하는 자동화한 열과PCR제품을 분석하기를 위해 새로운 계기는 발육시켰다. 새로운 열cyclers은 난방의 비율을, 변경한 반응 배에 냉각하고, 열전달 증가했다. 이민 1세 열cyclers(또는 근해 목욕 및 난방 구획에의해) 수용된 반응 배는 표준 플라스틱microfuge관 이었다. 얇은 모세관안에PCR확대는20s에 급속한 열 순환, 그리고DNA종합을 허용했다. 달성되는 이 시스템안에 온도 변화의 속도는PCR주기안에 각 개인적인 단계를 위해 온도 최적 조건의 정확한 정의를 허용했다. 새로운 발생 열cyclers에는 또한 부연 견본을 수용하고, 더 정확한 열 단면도가 있고, 풀그릴 이다 (13).

Oligonucleotide종합

PCR의 대폭적인 응용에 가장 작은 평가된 기여금의 한개은 올이g온읒러XX이d어 계속 종합을 위해 견실한 자동화한 화학의 발달 이다. 최근까지는, 단순한 올이g온읒러XX이d어의 건축은 숙련되는 유기 화학자에의해 단 이행할 수 있은 내용이 풍부한 업무 이었다. 어느 것이든 상업 학문적인 근원에서 기술공 또는 올이g온읒러XX이d엇 그들자신에의해 운영할 수 있는 올이g온읒러XX이d어 합성기를 구매하는것은 지금 가능하다. 다중 올이g온읒러XX이d어 종합 기계는 종합 (27,28)의 전반적인 비용을 감소하기의 조준에 건설되었다. 올이g온읒러XX이d엇이 최후PCR제품을 정의하기 때문에, 거의 확실하게 그들의 준비되어 있는 공급이 없을 경우에,PCR은 않않을텐데 넓을 지지를 얻은 오늘 (13).

뇌관 디자인

PCR뇌관의 디자인이 곤란했던 것을 연구원은 일찍부터 합의했다. 디자인 표준의 모두를 고려하기 위하여 컴퓨터 프로그램은 고안되었다. 뇌관 디자인을 위해 쓴 첫번째 프로그램의 한개은Atari가 (29)에 디지털 연구 주옥 (도표 환경 매니저)의 실시를 사용한Olga이었다. Olga은 2개의 뇌관 순서의 동시 분석을 허용하는 폴리메라이제 연쇄 반응 (PCR)에 명확하게 편리되었다. Olga의 이점은PCR최적화와 올이g온읒러XX이d어 종합안에 접전된 노동자를 위해 몇 유용한'끝마무리'공구뿐 아니라 직접적인 반복, 이차 구조 및 뇌관 이합체화를 위해 1개의 프로그램 분석안에 제공했다 고 이었다. Whitehead학회에Primer3프로그램은 현재 가능한 가장 견실하고 가장 다재다능한 공구 이고 지금 생각한다 (30).

오늘의PCR

PCRs은 더 보다는 일백만 번까지 길이안에 지금 수 있어DNA파편의 확대를 실행될 그들의 처음 풍부 몇kilobases까지 가능하게 한. 절차는 높게automatable이고 제품 분석에thermocyling을 시작하기에서 다만 약간 시간을 요구한다. 이것은 사실이 아니고 이전에 이고지 않,PCR을 실행하기를 위해 실제적인 필요조건은 방법 (13)의 첫번째 원고부터 중대하게 간단하게 했다. 오늘, 처음 까탈의 최대량 또는PCR의 비능률적은 (8) 운동했다. 게다가270,000이상을 기사 (31)을 포함하기 위하여,PCR은 확장했다.

PCR은 이제까지 대체될 것인가? – helicase의존하는 확대 (HDA)

폴리메라이제 연쇄 반응은 시험관 내DNA확대를 위해 널리 쓴 방법 이다 그런데 열 변성 또는 2개의DNA물가를 분리하기 위하여thermocycling을 요구하는. In-vivo,DNA은 각종 부속 단백질에DNA폴리메라이제에의해 복제한다. 세포안쪽에 이중DNA을 분리하기 위하여DNAhelicase은,DNA폴리메라이제 부속 단백질 행동한다. Vincent그 외 여러분. (32)은 생체 조건 복제 기계장치를 흉내내기 서 새로운 시험관 내 등온선DNA 확대 방법을 고안했다. 뇌관 교잡을 위해 단순하 배가 좌초한 템플렛을 생성하기 위하여helicase의존하는 확대 (HDA)은DNAhelicase을 이용한다. 연속적인 뇌관 연장은DNA폴리메라이제에의해 그때 촉매 작용을 미친다. HDA은 비싸thermocycler을 요구하고지 않 이렇게PCR은 실제적으로 어느 곳에서든지 실행될 수 있는다. 더하여, 그것은 간단한 반응 계획을 있고음 및 전과정을 위해 1개 온도에 실행될 수 있는 진실한 등온선 반응 이어서서 다른 등온선DNA확대 방법에 몇 이점을 제안한다. HDA은 분야안에 그리고 점 의 배려 (32)에 사용되는 간단한 휴대용DNA진단상 장치의 발달안에 중대한 약속을 제안한다.

결론

PCR을 정의하는 가장 간단하고 가장 편리한 방법이 기술으로 이다 것 을 말한다. 그런데, 그같은 분류는PCR's발달의 역사를PCR의 이론 및 기술의fine-tuning뒤에 아이디어에 공헌되는 만큼 많은 개인 수넌에 걸쳐 삭제한다. 다음 가장 간단한 응답은 폴리메라이제 연쇄 반응의 발명자로 개인을 이름을 댄것을 이다. KarryMullis은PCR의 그의 발견을 위해1993년에 화학을 위해 노벨상을 수여되었다. 그런데, 이 발견은 이 수수께끼를 자물쇠로 열에 공헌할 수 있는 많은 과학자의 사이에 겨룬다.
실험적인 시스템안에 일하기 위하여 만들l 까지PCR이 존재하지 않았다 고 또한 말했다. 마음안에 이것에, 단순하게 개념의 생각은 충분하지 않다; 개념은 연습 (33)으로 성공적으로 뒀음 에.
PCR여하튼 또는 언젠가 대체된 일지모른다 고PCR의 궁극적인 창조자에 관해서는 의혹, 그리고 가능성에 관해서는 의혹 있어도, 약간 의혹PCR이 분자 생물학 및 생활의 학문에 조업 단축 경간에 만들은 충격 있는다.

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