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분자 생물학 - 과학은 인용한다

과학은 이 발생의 바보가 마지막 발생의 천재에의해 도달하는 점저쪽에 갈 수 있는 어떤 분야 이다. ~MaxGluckman,Politics,Law및Ritual1965년

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재조합형 단백질 표정

너가 관심사의 유전자 또는 단백질을 성격을 나타내골 싶을 때, 너는 첫째로 그것의 기능을 공부해야 한다. 이 분자 시대안에, 관심사의 너의 유전자의DNA을 얻음것은 곤란하지 않다.

단백질으로DNA을,ie은 재조합형 단백질 내색하기 위하여는, 것 그때 쉽게 재조합형 순화한 단백질을 사용하여 기능적인 학문을 실행할 수 있는다.

너는 순화한 단백질이 있으면 하자마자 너는 지휘할 수 있는다:

단백질 단백질 상호 작용은 실험한다
효소 활동
단백질의 기능적인 학문
구조상 학문 - 단백질 결정화, 단백질 구조 및NMR을 포함하여 -.
더 실험을 위해 항체를 만들 위하여 너는 또한 단백질을 이용할 수 있는다.

재조합형 단백질의 표정을 위해 2개 주 시스템 있는다. 너가 너의DNA을 복제해 얻으면 하자마자, 너는 너가 너의 단백질을 증폭하고 싶는 곳에 결정해야 한다. 이것은prokaryotic(세균성) 또는 진핵 (흔하게 효모 또는 포유류 세포) 시스템 이을 것이다. E.Coli안에 작용하는 다른 발기인 및 효모 또는 포유류 시스템을 잘 사용하는 다른 사람 있기 때문에 어느 선그림 너가로 너의DNA을 복제하는것을 필요로 할 것이다 까 너의 시스템의 선택은 결정할 것이다.

이렇게 단백질 표정 시스템이 너 사용하기 위하여?

단백질 표정을 위해 시스템

Prokaryotic단백질 표정 시스템

Prokaryotic재조합형 단백질 표정 시스템에는 몇 이점이 있는다. 이들은 너가 너의DNA을 복제하면 하자마자 세균성 시스템에게서 단백질을 얻기 위하여 너가 오랫동안 기다려야 하지 않을 것이다 아주 급속한 세포 성장 의미 그리고 문화의 용이를, 포함한다. 표정은IPTG을 사용하여 세균성 단백질 표정 시스템안에 쉽게 유도될 수 있는다. 또한, 정화는prokaryotic표정 시스템안에 확실히 간단하 재조합형 단백질 표정을 위해 유효한 상업적인 장비의 다혈증 있는다.

이와 반대로, 너가 기능 효소 학문을 위해 너의 단백질을 이용하기 위하여 필요로 하면 가장 큰 단백질이 봉합체안에 불용해성에 되는 때prokaryotic시스템은 문제 이고 기능적인 단백질으로 재기하기 아주 곤란하다. 게다가, 최대량은 박테리아에의해 그렇지 않으면 모든 지점 번역상 수정 추가하고지 않 그런 까닭에 관심사의 너의 단백질은 기능적 이지 않을지도 모르지 않는다. 효소 학문은 이렇게 열매를 맺지 않을 지도 모른다.

진핵 표정 시스템

prokaryotic선그림의 “” 통제의 밑에 내색될 때라도, 진핵 유전자는prokaryotic세포안에 진짜로 집에서. 1가지의 이유는e콜라이 세포가 제삼자로 빈번하게 복제한 진핵 유전자의 단백질 제품을 인정하고 파괴한다 고 이다. 또 다른 한개는prokaryotes이 진핵생물이 것과같은posttranslational수정의 종류를 실행하지 않는다 고 이다. 예를 들면 복제한 때, 진핵 세포안에 설탕에 정규로 결합될텐데 단백질은 벌거벗을 단백질으로 박테리아안에 내색될 것이다. 이것은 항체에 단백질’s 활동 또는 안정성, 또는 적어도 그것의 응답을 초래할 수 있는다. 더 심각한 문제는 세균성 세포의 내부가 진핵 세포의 내부로 진핵 단백질의 적당한 폴딩에 공헌하는것과 같이 이지 않는다 고 이다. 빈번하게, 결과는 부적당하게, 복제한 유전자의 비활동성 제품 접힌다.

단백질의 표정을 위해 진핵 시스템은 포함한다:

효모
포유류 세포
baculovirus세포 (곤충)

모든 이 시스템은 재조합형 단백질의 표정을 위해 중대한 진핵 시스템 이다.
진핵 단백질 표정 시스템의 이점은 너가 표정의 아주 상부를 얻을 수 있는다 고 사실을 포함한다. 단백질은 그의것을 포함하여 선그림으로 포함하는 특별한 꼬리표,Myc및 다른 꼬리표을 사용하여 순화하기 쉽다.

너는 조차 매체로 너의 단백질을 은닉하는 플라스미드를 구매할 수 있는다. 그런 까닭에 너는 너의 시스템을 성장하고 너의 세포를lysing없이 매체를 모은 유지할 수 있는다. 우려할 것이다 봉합체 있고지 않 너의 단백질에는 본래 지점 번역상 수정이 있는다. 너가 단백질 그리고/또한 단백질 단백질 상호 작용의 기능을 공부하면 이들은 생명 이다.

진핵 단백질 표정 시스템의 불리는 진핵 세포가prokaryotic세포보다는 더 느리게 성장한다 고 사실을 포함한다.

강한 발기인과 표정 선그림

표정 선그림의 주 함수는, 부연 제품 더 나은 것 유전자의 제품을 흔하게 열매를 산출하는 이다. 그런 까닭에, 표정 선그림은 아주 강한 발기인에 정규로 갖춘다; 이론적 설명은 고 이다 부연mRNA이 생성하면, 부연은 단백질 제품은 만들l.
1명의 그런 강한 발기인은trp(트립토판operon) 발기인 이다. 그것은ptrpL1을 포함하여 몇 표정 선그림을 위해 기초를, 형성한다. 그것은trppromoter/operator지구를 리보솜 의무 사이트에의해 따라 달라고 하고, 표정 선그림으로ClaI사이트로 외국 유전자를 삽입해서 직접적으로 사용될 수 있는다. 양자택일로,trp통제 지구는 그것을 밖으로ClaI “과” HindIII에 휴대용에게 자르고기 다른 선그림안에 내색될 것이다 유전자앞에서 삽입해서 할 수 있는다

유도할 수 있는 표정 선그림

우리가 그것을 내색하게 준비되어 있을 까지 흔하게 복제한 유전자를 지키는것은 유리하다represed. 1가지의 이유는 박테리아안에 다량으로 생성하는 진핵 단백질이 유독할 수 있는다 고 이다. 이 단백질이 실제적으로 유독하지 않으면 비록, 세균성 성장에 방해한다 고 쌓아 올린다 아읓 중대한 수준을 할 수 있는다. 단백질 제품의 의미심장할 양을 일으키기 위하여 복제한 유전자가 켜 일정하게 남아 있는 두면 둘중에 한 경우, 중대할 충분히 농도가 유전자를 품는 박테리아에 의하여 결코 되지 않을텐데. 해결책은 복제한 유전자를 끌 수 있는 유도할 수 있는 발기인downstream.of그것을 두어서 꺼 지킨것을 이다.
랙 발기인은 유도할 수 있는다 어느 정도까지, 합성 유도 물질isopropylthiogalactoside(IPTG)에의해 자극하는까지 아마 떨어져 잔여. 그런데, 랙 억제체에의해 일으키는 원인이 되는 진압은 불완전하, 복제한 유전자의 어떤 표정은 유도 물질이 없을 경우에 조차 관측될 것이다. pBS이 대로, 이 문제의 주위에 편도는 그것의 자신의lacI유전자를 나르는 플라스미드 또는phagemid안에 우리의 유전자를 내색한것을 이다. 우리가IPTG에 그것을 유도하게 준비되어 있을 까지 끈 우리의 복제한 유전자가 그같은 선그림 보유에 의하여 과잉 억제체에 의하여 생성했다.
다른 전략은 살균소 발기인 통제선으로 단단하게 통제한 λ 발기인을 사용하는 이다. 이promoter/operator시스템에 표정 선그림은 온도 과민한 억제체 유전자 (c1857)을 품는 λ 호스트 세포로 복제한다. 우리가 이 세포의 온도를 관계되 낮을 (32캜) 지킬 한, 억제체는 작용하고, 표정은 일어나지 않는다. 그런데, 우리가nonpermissive수준에 온도를 (올릴 때42ºc)은, 온도 과민한 억제체 더이상 작용할 수 있고지 않 복제한 유전자는 유도된다.

융해 단백질을 생성하는 표정 선그림

가장 큰 표정 선그림이 운영할 때, 융해 단백질이 그들에 의하여 생성한다. 삽입되기 유전자의 자연 산물이 제작하지 않기 때문에 이것은 첫째로에 불리에 보인. 그런데, 융해 단백질에 여분 아미노산은 단백질 제품을 순화하기안에 중대한 도움 이을 수 있는다.

한개에는 상품명pTrcHis이 있는oligo히스티딘 표정 선그림을 사려하십시요. 이들에는 6 히스티딘의 뻗기를 부호 매기는 다각 클로닝 사이트의 상류에 짧은 순서가 다만 있는다. 따라서, 그같은 선그림안에 내색된 단백질은 그것의 아미노 끝에 6 히스티딘에 융해 단백질 이을 것이다. 우리는 왜 우리의 단백질에 6 히스티딘을 붙이고는가 싶는가텐데? 이것oligo히스티딘 지구에는 니켈을 위해 금속을 위해 높은 친화력이 있는다, 그래서 우리는 니켈 친화성 크로마토그래피을 사용하여 그런 지구가 있는 단백질에는 순화할 수 있는다. 이 방법의 아름다움은 그것의 간명 및 속도 이다. 박테리아가 융해 단백질을 만들n 후에, 우리는 간단하게 그들을lyse, 니켈 친화력 란에srude세균성 추출물을 추가하고, 밖으로 모든 해방되는 단백질을 세척하고, 그때 히스티딘 히스티딘 아날로그 부른 이미다졸에 융해 단백질을 풀어 놓는다. 이 절차는 우리들을 근본적으로 단 1개 단계안에 청정한 융해를 가을걷이하는 허용한다. 어떤 자연적인 단백질에는oligo히스티딘 지구가 있으면 아주 몇몇, 그래서 우리의 융해 단백질이 근본적으로 란에 묶는 유일한 것 이기 때문에 이것은 가능하다.

우리가oligo히스티딘 꼬리표의 우리의 단백질을 함유하지 않는 원하면 무엇?

이 선그림의 디자이너는 신중하게 그것을 제거하는 방법을 제공했다. 다각 클로닝 사이트의 바로 전에, 단백질 가수 분해 효소enterokinase에의해 인정되는 아미노산의 뻗기를 위해 코딩 지구 있는다. 2개 부품으로 융해 단백질을 쪼개기 위하여 이렇게 우리는enterokinase을 이용할 수 있는다: 우리가 원하는 단백질 및oligo히스티딘 꼬리표. enterokinase에의해 인정되는 사이트는 아주 희소하, 우리의 단백질안에 존재한다 고 기회는 하찮다. 따라서 우리가 그것의oligo히스티딘 꼬리표를 제거하는 때, 우리의 단백질은높은 쪽으로 잘게 자르면 안된다. 우리가 원하면, 관심사의 단백질에서oligo-hisitidine파편을 분리하기 위하여 우리는 니켈 란을 통해서enterokinase쪼갠 단백질을 다시 한 번 달릴 수 있는다.

λ 페이지는 표정 선그림을 위해 기초로 또한 봉사했다; 이 목적을 위해 명확하게 디자인되는 것개은gt11 λ이다. 이 페이지는lacZ유전자에의해 따르는 랙 통제 지구를 포함한다. 클로닝 사이트는lacZ유전자안에 위치한다, 그래서 이 선그림으로 삽입된 유전자의 제품은b갈락토시다아제의 지도자와 융해 단백질 이을 것이다.
표정 선그림 λgt11은DNA도서관을 만들 가리기를 위해 대중적인 차량이 되었다. λgt11은 우리들을 우측 단백질의 표정을 위해 복제품의 그룹을 직접적으로 가리는 허용한다. 이 절차를 위해 요구되는 주요한 성분은gt11안에DNA도서관 λ과 관심사의 단백질향하여 지시되는 항혈청 이다.
우리는 각종DNA λ 삽입에 우리의 페이지를 도금하고 니트로셀룰로오스같은 지원의 위에 각 복제품에의해 풀어 놓는 단백질을 더럽힌다. 우리가 각 패로부터 니트로셀룰로오스로 단백질을 옮기면 하자마자, 우리는 우리의 항혈청에 시험한다. 다음, 우리는Staphylococcus-aureus에서 레테르를 붙인 단백질A을 사용하여 특별한 패에서 단백질에, 도약되는 항체를 찾는다. 이 단백질에 의하여 항체에 단단하게 묶고 니트로셀룰로오스에 해당 반점이 레테르를 붙인다. 우리는 방사선 사진술 또는phosphorimaging서 이 레이블을 검출하고, 우리의 마스터판에 그때 가고 해당 패를 쑤신다. 관심사의 것을 단백질 는 아니고 자체 것 을 우리 검출하고 있는 융해 단백질을 주의하십시요. 게다가 우리가 전체DNA을 또는 아니다 복제하면, 그것은 중요하지 않다. 그것의 코딩 지구가b갈락토시다아제 코딩 지구와같은 동일한 오리엔테이션과 독서 프레임안에 복제할 한, 우리의 항혈청은 우리의 단백질의 몇 다를 부분에 반작용할 것이다 항체의 혼합물, 이렇게 조차 부분적인 유전자 할 것이다 이다.

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