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생활의 가장 슬픈 양상은 지금 과학이 지견을 사회 집결 지혜보다는 빨리 모인다 고 이다. ~IsaacAsimov의 과학과 성격Quotations1988년의IsaacAsimov's책

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GenomicDNA격리 프로토콜

GenomicDNA정화 방법을 선정한

격리다음에DNA의 응용 무엇에genomicDNA격리의 목표는 의존한다. DNA의 순수성, 근원, 양 및 질은genomicDNA적출보다 전에 언급한것을 필요로 하는 모든 문제점 이다. 다른 방법의 전체 호스트, 기술 및 장비는 세포에서genomicDNA을 고립시키는 연구원에게 유효한 지금 이다.

자가 생산 실험실 명확한DNA적출 방법은 수시로 확실히 잘 그들을 개발한 실험실을 위해 일정하게 이 프로토콜을 사용하고.

주는 그런데 이 방법 규격화를 결여된다. 또한DNA수확량 및DNA질은 항상 1명의 사람에게서 다음에 재생 가능하지 않다.

GenomicDNA격리와 정화에 배경

일반적으로, 모든 방법은 세포의 붕괴 그리고 세포의 용해를 관련시킨다. 이것은RNA의 제거에의해 때때로 따른다 (RNAses, 소금 또는 다른 방법에 의하여). 어느 방법 사용함것은을 포함하여 많을 선택 요인에 의존할 것이다 까 선택한:

DNA은 효소 단백질 가수분해 효소K.Proteins에의해 단백질의 소화를 포함하여 몇 방법에의해 단백질에서DNA의 염석, 유기 적출, 또는 묶어서 제거된다solid-phase지원에 연속적으로 고립시킨다 (안이온-어x창어 란 또는 실리카 기술).

DNA은 에타놀 강수 또는 이소프로판올 강수에의해 마지막으로 재기된다.

장군안에, 세포에서DNA의 별거 및 세포질 분대는 4개의 단계로 분할될 수 있는다:

  1. 세포 붕괴
  2. 세포의 세포의 용해
  3. 단백질과 오염물질의 제거
  4. DNA의 회복

몇몇genomicDNA격리 프로토콜안에, 단계 1과 2은 결합된다.


물자는GenomicDNA적출 방법을 위해 필요로 했다

GenomicDNA조리법을 위해 세포의 용해 버퍼:

50밀리미터Tris-HCl, pH8.0
50mMEDTA
1%SDS
10mMNaCl

조직 추출에서GenomicDNA정화 방법

  1. 사용하기 위하여 조직 추출을 선정하십시요. 견본이 얼음에 적당하게 준비되고 지킨다 것 을 확인하십시요. 견본이DNA적출을 위해 즉시 이용하지 않으면, 그때 견본은 훨씬 장기간을 위해-20캜냉장고 또는 단기 (몇몇 시간) 사용법을 위해4캜안에 적당하게 저장되어야 한다.
  2. 더 작은 조각으로 커트 직물. 간 또는 다른 연약한 직물를 위해, 정밀한 조각을 만들에 관하여 고민하지 말라.
  3. 직물을 발송 전에 인공적으로 냉각한 (드라이 아이스) 박격포에 추가하고십시요, 즉시 액체 질소n2을 추가하십시요.
  4. 정밀한 분말으로 직물을 갈n것을 시작하십시요. 필요로 하는에 따라서 부연Liq.N2을 추가하십시요. 30ml관, 모자를 벗기는 허가로 차 분말을 옮기십시요 그래서n2은 증발할 수 있는다.
  5. 당 데운 (5캜) 세포의 용해 버퍼의 9ml을 추가하고 온후하게 분말을resuspend.
  6. 단백질 가수분해 효소K의10mg/ml의 100개의 을을 추가하십시요, (해결책안에i.e, 100 으g). 55캜을1-18시간 알을품으십시요. 온후하게 정기적으로 섞으십시요. 첫번째 2 시간다음에 단백질 가수분해 효소K, 최적 조건의 100개의 을을 추가하십시요: 1.5시간에 단백질 가수분해 효소K을 추가하는 3 시간.
  7. 치료 견본 아주 온후하게. 3MNa0Ac(pH4.0)의 1ml을, 온난한 (55캜) 석탄산의 10ml추가하고십시요,5-10분을 위해 온후하게 그러나throughly섞으십시요.
  8. 15분을 위해 견본을 원심 작용을 받게 하십시요.
  9. 온난한 석탄산 적출을 반복하십시요.
  10. 동등한 양 (10ml) 석탄산에 추출물: CIA(1개 부품phenol:1부속CIA: CIA=isoamyl알콜23부품chloroform:1부속)
  11. 동등한 양 (10ml)CIA적출에 추출물
  12. 큰 백색 강타를 포함하면, 위 단계는 관계되 명확해야 하고 또는 아주 유백색 이다, (i)은68캜15분, 그리고 재 석탄산 추출물에, (ii) 시작 다시 알을품고, 그러나P-K에 오랫동안 알을품는다.
  13. 새로운 관에 이동 위 단계. 차 에타놀의 2개 양을 추가하고 온후하게 섞으십시요 (소금: Na0Ac은 해결책안에 이미 있는다). 훅 및 계인한pasteur을 사용하여DNA에서 스풀을 피펫으로 옮기십시요. 떨어져 관의 측에 과잉 에타놀을 닦으십시요. TE의2-5의mls안에Resuspend. DNA이 완전하게 녹인다 것 을 확인하십시요 (온후한 셰이커에 허가.)
  14. RNase혼합 (RNaseT1의RNaseA,10U의 100 으g)을 추가하십시요. 30최소한도37캜을 알을품으십시요. ** 너는 단백질 가수분해 효소K의 앞에RNase을 추가할 수 있고, 1 시간을 위해37캜에 알을품고 그때 단백질 가수분해 효소 소화를 시작한다. 너는 그때 단계15을 건너뛸 수 있었다 -.
  15. 단백질 가수분해 효소K의incubae37캜의 100 으g을30분 추가하십시요.
  16. 1/10의vol.3MNa0Ac의 석탄산 추출물을 한 번,Phenol:CIA추출물 두번,CIA추출물 한 번 추가하십시요.
  17. EtOH의2.5양을 추가하고십시요,-20캜안에30분 두십시요. 20분을 원심 작용을 받게 하십시요.
  18. 잘70%에 세척하고십시요, 모든EtOH을 제거하십시요. 너가 말리면, 건조한 정상은.
  19. 주의깊게 버퍼, 느리게in1-2mlsTE(trisTris-EDTA)Resuspend. (1x또는0.1x).

 

 

 

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