Bioinformatics의 프로토콜,DNARNA단백질Proteomics
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과학의 중대한 남자는 최고 예술가 이다. ~MartinH.Fischer
저작권2007분자 역
footprintingDNase은 재산을 이용해서DNA에 상호 작용하는 단백질은 금지 소화 또는DNAase효소 분열에서 저 상호 작용 사이트에DNA을 보호할 고dna단백질 상호 작용의 탐지를 가능하게 하는 분자 생물학 방법 이다. 명확한 의무 사이트를 포함하는DNA금지 파편은32P에 1개의 끝에, 흔하게 레테르를 붙이고footprinting을 위해 이용한다.
단백질과DNA은 함께 교배시키, 묶는 둔다.
멀리 자유롭게 단백질에게 행이는DNA을 보호되어 떠나는 방사선(또는레테르를 붙이는)DNA을소화하나 자르기 위하여footprintingDNA은 효소DNasei또는deoxyribonucleic산성nucleasei을 이용한다. DNA금지 파편은DNA안에 단순하 물가 틈 (흠)을 만들는DNasei에 가볍게 대우된다. 더 적은 보다는 1nick/strand의 평균 있는다 고 소량 효소는 그런이라고 이용한다. 반응은 그때 멈춘다,DNA은 변성시키고, 혼합물은 젤을 연속 변성시키는 볼XXry람이d어에 달린다. 보호된DNA지역을 검출하기 위하여 젤 전기 이동법에의해 분리하는 이 파편은 젤에 밴딩 분열 패턴을 분석해서 드러낸다.
전형적으로 자유로운DNA으로 알려지는DNA의무적인 단백질이 없을 경우에DNA의 분열 패턴은,DNA의무적인 단백질의 면전에서DNA의 분열 패턴에 비교된다. 단백질이DNA을 묶으면, 의무 사이트는 효소 분열에서 보호된다. 이 보호는 "발자국"으로 알려지는 젤에 지움 영역안에 유래할 것이다.
dna묶는 단백질의 농도를 변화해서, 단백질의 결합 친화성은 발자국이 관측되는 단백질의 최소한도 농도에 따르면 견적될 수 있는다.
KCl없이/10mls을 위해2X:
총계: [마지막]
Tris-HClpH7.6: 1M의500의 을:
50밀리미터
MgCl2: 1M의125즩l: 12.5mM
EDTA: 0.5M의 2개의 을: 1mM
글리세롤: 2개의mls: 20%
DTT: 1M의 10의 을: 1개
밀리미터
KCL없이5X
[마지막]: 성분
20%: gylerol
5mM: MgCl2
2.5mM: EDTA
2.5mM: DTT
250mM: NaCl
50mM: Tris-HCL, pH7.5
0.25mg/ml: 많은 (디디뮴 피해
통제) 많은 (디디뮴 피해 통제)
10mls를 위해
CaCl2: 1M의50의 을: 5개
밀리미터
MgCl2: 1M의 100개의 을: 10
밀리미터
선적 해결책
0.1 M: NaOH:formamid(1:2v/v)
0.1%: 크실렌cyanol
0.1%: br옴XX언올 파랑
정지 버퍼
10mls
NaCl: 5M의400의 을: 200
밀리미터
EDTA: 0.5M의600의 을:
30밀리미터
SDS: 1ml10%: 1%
TEBe(trisEDTA 베타mercap.)
Tris-HCl, pH7.6: 1개M의500의 을:
50밀리미터
EDTA: 0.5M의2즩l: 1개
밀리미터
베타 b얻아-머r잡도XX안올: 10의 을:
15mM
10의xK버퍼
1ml를 위해
Tris-HClpH7.5: 1개M의 100개의 을:
100개 밀리미터
MgCl2: 1개M의 100개의 을:
100mM
DTT: 1M의50의 을:
50밀리미터
dH2즁: 750의 을
이용하는DNA은 흔하게 관심사의 너의 단백질의 의무 사이트를 포함한다. DNA은 금지 파편에appopriate크기의 이기 위하여 순화되고, 그때 소화된다. DNA파편은 1개의 끝 (의무 사이트>끝에서25bp)에 레테르를 붙인다.
1장의 물가 레테르를 붙임것은accomplised곁에 이을 수 있는다:
Klenow파편를 위해,0.3즩g은TE안에 100개 종사하고를 을, 10 분을 위해68캜에 열 삭제Klenow을 가져온다.
견본RXN: 15ng은 각 반응을
위해 필요 이다. 많은 반응DNA의 정당한
증가 총계를 위해 조사를300의ngs까지 만들n
만약에.
15ng: DNA파편
2개의 을: 10xK버퍼
5개의 을: 32PdCTP3.33으M 10uCi/ul
2개의 을: 2mM@dA, dGdTTP
1개의 을: Klenow
20의 을 마지막 양,37캜30분.
-- 1개의 을10mMdNTP, 5 분@37캜을
추가하십시요.
--80의 을TE을 추가하십시요.
68캜은15분, 위에 얼음을 뒀다.
--G-50회전급강하 란 (대략2000g에
회전급강하)
Na0Ac,2.5양--EtOH1/10의vol.3M을,
얼린다30분을, ([DNA]=또는>3ng/ul이 이으면
선택 너는G-50을 직접적으로
배치한)Microfuge30분 추가하십시요.
--70%에 세척하십시요
-- 건조한5즩l위로 초래하십시요
의무적인 반응은
10과150mMKCl사이에 있어야 한다 (부연 소금은
묶는 그러나 증가 특이성 감소한다).
전형적인 농도는50mM이다.
단백질DNA바인딩:
KCl없이2X의무적인 버퍼의25의 을
3ng/ul의5즩l은DNA을unilabeled
KCl10-150밀리미터 같게
하는KCl의x을
바인딩을 위해 양마이너스 동등한
것50을에dH20은protien
1-3DNA의무적인
단백질의Footprinting단위 (또는 조잡한 핵
추출물의 10 에160으g)
-- 온후하게, 얼린다 10 분을 섞으십시요.
마음안에 타이밍을 지키십시요,
--RTCa/Mg해결책, 1 분을
위해18캜의50의 을을 추가하십시요.
-- 묽게 하는RQ1DNase(Tris안에 묽게
하는0.05u/ul)이 1 분을 알을품는 3개의 을을
추가하십시요.
--37캜정지 해결책에90의 추가를
멈추십시요,
-- 석탄산이 만일 너:
CIA및CIA추출물 및 에타놀 침전물.
-- 선적 해결책의4즩l안에resuspend.
--DNA사다리, 자르지 않는DNA, 및
통제같은appopriate선적 차선에 젤을 (쐐기
젤을 사려하십시요) 연속5%표준 우레아Dna에
달리십시요.
footprinting패턴을 분석하십시요.
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