SDS-PAGE

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SDS-PAGE

SDS-PAGEのプロトコル

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分析されるべき蛋白質の解決はSDSの二次のおよび非二硫化物リンクされた第三構造を変化させる混合され、各蛋白質に大容量に比例して負電荷を加える陰イオン洗剤と最初に。 SDSなしで、同じような分子量の異なった蛋白質は折ることの相違が別様に原因で移行する、折るパターンの相違によりある蛋白質は他よりゲルのマトリックスを通して適合をよくしたので。 分子量(一次構造、または番号(およびアミノ酸のサイズ))厳しく分かれているように蛋白質を一直線に並べるので、SDSを追加することでこの問題を解決できる。 SDSはおよそ均一大容量を与える1.0 g蛋白質ごとのおよそ1.4 g SDSの割合で蛋白質に(結合の比率が1.1-2.2 g SDS/g蛋白質から変わることができるが)結合する: ゲルを通る移行の間隔が直接蛋白質のサイズだけと関連していると仮定することができるように、ほとんどの蛋白質のための充満比率。 追跡の染料は蛋白質の解決に実験者が電気泳動の実行の間にゲルを通して蛋白質の解決の進歩を追跡することを可能にするように追加されるかもしれない。

化学原料および役割

"ポリアクリルアミドゲル(PAG) 1954年には早くもティッシュを区分するための潜在的な埋め込む媒体として"は知られていた。 2つの独立したグループデービスおよびRaymondは1959年に電気泳動のPAGを用いた。 それはそれに多目的な媒体をした複数の電気泳動によって好ましい機能を所有している。 ポリアクリルアミドゲルはサイズおよび充満両方に従って蛋白質分子を分ける。 透過、比較的化学的に強い平均気孔のサイズの広い範囲と不活性総合的なゲル、thermo-stable準備することができたりさまざまな汚れ、destainingプロシージャに実行可能な高圧勾配に抗、分けられた一部分を得ることを消化するか、または放射線写真法および常置記録のために乾燥することができる。 ディスク電気泳動は異なった気孔のサイズのゲルを利用する。 一流ディスクは電気泳動のマトリックスの不連続と同時にイオン(Anbalagan 1999年)の分けられたゾーンの円盤状の形から得られた。 ゲルの2つの層あり、即ちスタックするか、またはスペーサのゲルが、および解決するか、または分けるゲルを。

ゲルのスタック

スタッキングのゲルは大きい気孔のポリアクリルアミドゲル(4%)である。 このゲルは約2つのpHの単位の低のTrisバッファpH 6.8と電気泳動バッファのそれより準備される。 これらの条件はKohlrauschの反作用に環境を提供する、その結果、蛋白質は複数に19の等級のフォールドそして薄い開始のゾーン集中されるか。mは数分の内に達成される。 このゲルは解決のゲルに投げられる。 スタッキングのゲル領域の高さは適用されるべきサンプルの維持された多くにより二重高さそしてボリューム常にだった。

解決のゲル

解決のゲルは小さい気孔のポリアクリルアミドゲル(3 30%)である。 使用されるTrisバッファはpH 8.8である。 このゲルでは、マクロ分子はサイズに従って分かれる。 現在の実験では、8%、10%および12%の解決のゲルは蛋白質の別の範囲を分けるために使用された。 24のâ€のための8%のゲル「205のkD蛋白質、14-205のkD蛋白質のための10%のゲルおよび14-66のkD蛋白質のための12%のゲル

化学原料

• Tris (tris (ヒドロキシメチルの) aminomethane) (C4H11NO3; MW: 121.14)。 それはバッファとしてそれがほとんどの蛋白質へ無害の物質であるので使用された。 そのpKaはpHの範囲7.0の†「9.0の20 °Cそして適度に非常に満足なバッファに8.3である。

• グリシン(アミノの酢酸) (C2H5NO2; MW: 75.07)。 グリシンは引きずるイオンまたは遅いイオンのソースとして有効な移動性はpHの範囲の純負電荷の最も遅い知られていた蛋白質のそれの下の値でセットすることができることpKaが9.69であるglycinateの移動性がそのような物であるので使用され。 この範囲の最小値pHはおよそ8.0どこかにある。

• Acrylamide (C3H5NO; MW: 71.08)。 それは白い結晶の粉である。 水で分解している間、acrylamideのautopolymerisationは起こる。 acrylamideの分子がテール方法のヘッドによって一緒に結合するのは遅い自発プロセスである。 しかしシステムを生成する遊離基の存在でacrylamideの単量体は自由根本的な状態に作動する。 これらの作動した単量体はすぐに重合し、長い鎖ポリマーを形作る。 この種類の反作用はビニールの付加重合として知られている。 これらのポリマー鎖の解決は鎖が互いに単に滑るので、粘性になるが、ゲルを形作らない。 ゲルの形成はさまざまな鎖の一緒に引っ掛けを必要とする。 Acrylamideは神経毒である。 autopolymerisationおよび加水分解を減らすために涼しく暗く、乾燥した場所でacrylamideを保存することもまた必要である。

• Bisacrylamide (N、N’-Methylenebisacrylamide) (C7H10N2O2; MW: 154.17)。 Bisacrylamideは多acrylamideのゲルのための最も頻繁に使用された十字のリンクのエージェントである。 化学的にそれはnon-reactive端に2acrylamideの分子を持っていることについてつないだ接戦を考えられる。 Bisacrylamideは4 °C.で維持された。

• ナトリウムDodecyl硫酸塩(SDS) (C12H25NaO4S; MW: 288.38)。 SDSは個々のポリペプチドにネイティブ蛋白質を変化させるのに使用される共通の分離のエージェントである。 蛋白質の混合物がSDSの存在の100 °Cに熱される時、ポリペプチドのバックボーンのまわりの洗剤の覆い。 それはポリペプチドの1.4 g/gの一定した重量比率のポリペプチドに結合する。 このプロセスでは、ポリペプチドの本質的な充満はSDSによって貢献される負電荷と比較されたとき僅かになる。 従って処置が均一充満密度を所有している構造のような棒になった後ポリペプチドはそれ単位長ごとの同じ純負電荷である。 これらの蛋白質の移動性は分子量のロガリズムの線形機能である。

• アンモニウムの過硫酸塩(APS) (N2H8S2O8; MW: 228.2)。 APSはゲルの形成のための開始プログラムである。

• TEMED (N、N、N’、N’-tetramethylethylenediamine) (C6H16N2; MW: 116.21)。 acrylamideのゲルの化学重合はSDS-PAGEのために使用される。 それはアンモニウムの過硫酸塩および四基から成るアミン、N、N、N’、N’-tetramethylethylenediamine (TEMED)によって始めることができる。 生じるゲルの重合そして特性の率はAPSおよびTEMEDの集中によって決まる。 APSおよびTEMEDの量を増加することは平均ポリマーチェーン長さの減少、ゲルの濁り度の増加およびゲルの伸縮性の減少で起因する。 開始プログラムの量を減らすことは逆の効果を示す。 最適の一定期間以内に重合を可能にする最も低い触媒の集中は使用されるべきである。 APSおよびTEMEDは1つから10のmMの範囲で等モルの集中で、およそ使用される。

処理および視覚化のための化学薬品

次の化学薬品はそれで視覚化されるゲルおよび蛋白質のサンプルの処理のために使用される:

• ブロモフェノールの青(BPB) (3’、3’’、5’、5’’-Tetrabromophenolsulphonephthalein) (C19H10Br4O5S; MW: 669.99)。 BPBはユニバーサルマーカーの染料である。 蛋白質および核酸は大抵無色である。 それらが電気泳動に服従するとき、ゲルを逃げる前に実行を停止することは重要である。 BPBはアルカリおよび中立pHで実行可能であるので最も一般に用いられるであり染料を、それである小さい分子追跡する、イオン化可能であり、pH 4.6の上で負荷電、陰極の方にそれ故に移動する。 小さい分子移動するそれであることはほとんどの蛋白質および核酸に先んじて。 それが達すると同時に電気泳動の中型の電気泳動の陽極の終わりは停止する。 それは蛋白質と弱く結合し、青いカラーを与えることができる。

• グリセロール(C3H8O3; MW: 92.09)。 それは防腐剤および重量を量るエージェントである。 グリセロールの付加は頻繁に酵素の記憶のために(20-30か50%)推薦される。 グリセロールは非常に低温でフリーズしないで蛋白質の解決を、維持する。 それはまたロードしている間広がらないで井戸にサンプルの重量を量るのを助ける。

• Coomassieの華麗な青(CBB) (C45H44N3NaO7S2; MW: 825.97)。 CBBは最も普及した蛋白質の汚れである。 蛋白質と無指定に結合するのは陰イオンの染料である。 CBBの構造は主に無極性である。 従って通常methanolic解決(40%)および酢酸(7%)で(0.025%)使用される。 ゲルの蛋白質は酢酸によって固定され、同時に汚れる。 ゲルで組み込まれる余分な染料は同じ解決と染料なしでdestainingによって除去することができる。 蛋白質は明確な背景の青色帯域として検出される。 SDSはまた陰イオンであるので、プロセスの汚損と干渉するかもしれない。 従って、解決の汚損大量の汚損はは、ゲルのボリュームおよそ10倍の推薦される。

• Butanol (C4H10O; MW: 74.12)。 水によって飽和させるbutanolように解決のゲルのオーバーレイ解決使用される。

• 2Mercaptoethanol (HS-CH2CH2OH; MW: 78.13)。

SDS-PAGEの減少

SDSの付加のほかに、蛋白質は二硫化物連結の減少によって更に蛋白質を変化させる2mercaptoethanolかもしれ(ベータmercaptoethanol/BMEまたはdithiothreitol (従ってDTT)のような還元剤の前で近い沸騰に任意選択で簡潔に、第三蛋白質折りたたみのある形式を克服し、四基から成る蛋白質の構造(oligomeric亜単位を分割する)熱される。 これはSDS-PAGEの減少として知られ、最も広く使われている。 ネイティブ構造がそれ以上の分析(zymogramsの使用によって示されている例えば酵素活性)で重要なとき非還元SDS-PAGE (沸き、還元剤無し)は使用されるかもしれない。 例えば、量的なpreparativeネイティブ連続的なポリアクリルアミドゲルの電気泳動(QPNC-PAGE)は複雑な生物的マトリックスのネイティブmetalloproteinsを分けるための新しい方法である。

電気泳動および汚損

変化させた蛋白質は適したバッファで水中に沈むポリアクリルアミドゲルの層の1つの終わりに続いて加えられる。 電流は陽極の方のゲルを渡って移行する負荷電蛋白質はゲルによりを渡って応用である。 サイズによって、各蛋白質はゲルのマトリックスを通って別様に移動する: 短い蛋白質はゲルの気孔を通ってより容易に合われて、間大きい物持っているより多くの難しさ(より多くの抵抗に出会う)を決定する。 一定の時間後(通常hoursthoughはゲルを渡って適用される電圧によってこれ決まる少数の; より高い電圧はより速く動作するが、)、蛋白質特異的に移行してしまうサイズに基づいて幾分悪い解像度を作り出しがちである; より小さい蛋白質に原点に近い方に移動されたより遠い羽毛がゲル、間大きい物残ってしまうある。 従って蛋白質はサイズ(従って、分子量)に従って大体分かれているかもしれ。 電気泳動に従がって、ゲルは(最も一般にCoomassieの華麗で青いですか銀製の汚れと)かもしれ、分けられた蛋白質の視覚化を汚れる、または許可する更に処理される(例えば西部のしみ)。 汚損の後で、異なった蛋白質はゲル内の個別のバンドとして現われる。 それは実行ゲルの別の車線の知られていた分子量の「マーカー蛋白質」に共通、ゲルに目盛りを付けるためであり、間隔の比較によって未知の蛋白質の重量を定めることはマーカーに関連して移動した。 ゲルは実際にacrylamideの解決が少量を含んでいるので、2つのポリアクリルアミドの分子間の架橋結合を形作ることができるbisacrylamideの35の一般に約1部形作られる。 bisacrylamideへのacrylamideの比率は特別な目的のために変えることができる。 ゲルのacrylamideの集中はまた5%から25%まで範囲で、一般に変えることができる。 より低いパーセントのゲルはより小さい蛋白質を解決するために大いにより高いパーセントは必要であるが、高分子量蛋白質を非常に解決するためによりよい。 特定のacrylamideの集中のゲルを作るために一緒に混合することはラインですることができるかさまざまな解決のどの位定める

ゲルの電気泳動は通常信頼性および容易さによる蛋白質純度の試金として最初の選択である。 SDSおよび変化のステップの存在はサイズに蛋白質を基づいていたもっぱら分ける。 偽の陰性および陽性は可能である。 coの移行の汚染物は望ましい蛋白質と同じバンドとして現われることができる。 このcomigrationはまたゲルを突き通せない蛋白質を別の位置で動作するか、またはことができる。 こういうわけでスタッキングセクションを含む全体のゲルを汚すことは重要である。 Coomassieの華麗な青はまた糖蛋白質および繊維状蛋白質に定量化(Deutscher 1990年)と干渉するより少ない親和性と結合する。

バッファシステム

ほとんどの蛋白質の分離はかなりゲル内のバンドの鋭さを高める「不連続」バッファシステムを使用して行われる。 不連続ゲルシステムの電気泳動の間に、イオン勾配は蛋白質すべてが単一の鋭いバンドに集中する電気泳動の初期で形作られる。 これはより大きい気孔があるゲルの領域にゲルのマトリックスがイベントを「スタックすること」集中するか、の間に移行をまたは遅らせないように発生する。 それからSDS覆われた蛋白質「スタック」「追い越される」タンクのバッファからの否定的なイオンは蛋白質がより低いののふるう処置で続いて分かれるようにイオン勾配を、ゲルの「解決の」領域除去し。

多くの人々は~8.3-9.0のpHでスタックし、解決するtrisグリシンまたは「Laemmli」のバッファリングシステムを使用し続ける。 これらのpHsはシステインのpKaが8-9から及ぶので、そしてローディングバッファで現在の還元剤が蛋白質とco移行しないので特に高い濃度で時、蛋白質のシステインの残余間の二硫化物結束の形成を促進する。 バッファリングの技術の最近の前進はシステイン(例えば、減少の環境を維持するbistris、pH 6.5)のpKaよりずっと低くpHで蛋白質を解決することによってこの問題を軽減し、蛋白質に先んじるゲルに還元剤(例えばナトリウムの重亜硫酸塩)をその移動含んでいる。 より低いpHsが付いているバッファの使用の付加的な利益はacrylamideのゲルがより安定している従ってゲルが使用の前の長い一定期間の間保存することができることである。

SDS-PAGEのプロトコル

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参照

• 蛋白質の浄化、ボリューム182へのガイド

• 「蛋白質の銀製の汚損のelectroblotting膜そして増大の蛋白質の銀製の汚損はポリアクリルアミドゲルの電気泳動肛門Biochem 2002年」で分かれた。

• 「Tricineナトリウム1からの100 kDa肛門Biochem 1987年への範囲の蛋白質の分離のためのdodecyl硫酸塩ポリアクリルアミドゲル電気泳動」の。

• 「バクテリオファージT4の性質1970年のヘッドのアセンブリの間の構造蛋白質の開裂」。

また見なさい

• CN-PAGE

• BN-PAGE

SDS-PAGEバッファ

• SDS
• 連続したバッファ
• 10X連続したバッファ

ar: SDS-PAGEのCS: SDS-PAGE da: SDS-PAGE de: SDS-PAGE fr: Ãの‰のlectrophorèseのsur gel de dodA©cylsulfateeのポリアクリルアミドde sodiumそれ: SDS-PAGE nl: SDS-PAGEのja:か。か。か。か。か。か。か。か。か。か。か。か。か。か。か。 fi: SDS-PAGE sv: SDS-PAGE

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