セルTransfection

Transfectionはウイルスのベクトルを使用してeukaryoticセルに輸入原料の導入か転送の他の手段を記述する。

非ウイルス方法のためのタームtransfectionは菌類、藻およびプラントのような細菌そしてnon-animal eukaryoticセルで非ウイルスDNAの転送を記述するためにターム変形は好まれるが、哺乳類セルについて最も頻繁に使用される。

動物のセルのTransfectionは普通材料の通風管を許可するためにセル血しょう膜の一時的な気孔か「穴」を開くことを含む。 遺伝物質(supercoiledプラスミッドのDNAまたはsiRNAの構造物のような)、また更に抗体のような蛋白質は、transfectedかもしれない。 electroporationに加えて、transfectionはセル血しょう膜によって溶け、貨物を中沈殿させるliposomesを作り出すために材料とカチオンの脂質を混合することによって遂行することができる。

transfectionの本来の意味は伝染に終ってセルに「変形による伝染」、eukaryoteのウイルスまたはバクテリオファージからのDNA (またはRNA)のすなわち導入、だった。 ターム変形に動物の癌細胞の典型的な細胞生物学(文化の遺伝の変更長期伝搬を、か特性の獲得で別の感覚が許可する)あったので、タームtransfectionは、動物のセルのために、DNAの導入によって引き起こされたセル特性の変更の現在の意味を得た。

Transfectionは実験DNAが培養された哺乳類セルに入るかもしれない方法である。 そのような実験は通常DNAが表現されるかどうかテストするためにコード配列および調節領域(促進者、等)を含んでいるクローンとして作られたDNAを使用して行われる。 クローンとして作られたDNAが(例えば、促進者の蛋白質の結合サイトは変わるか、または除去されるかもしれない)広く修正されるかもしれないので、transfectionは特定の修正が遺伝子の機能に影響を与えるかどうかテストするために頻繁に使用される。

Transfectionの図表:

Transfectionアプリケーション

実験室のRNAを総合する機能は多くの技術に重大である。 Radiolabeledおよび非radiolabeled RNAのプローブは多くのプロトコルに必要となり、小規模の生体外のトランスクリプション反作用で容易に総合することができしみの交配およびヌクレアーゼの保護試金の使用を許可する。

• ベクトルかDNA
• セル
• Transfectionの試薬

生体外のトランスクリプションは促進者、ribonucleotideの三リン酸塩、DTTおよびマグネシウムを含んでいるバッファシステムを含んでいる浄化された線形DNAのテンプレートを必要とする

生体外のトランスクリプションは促進者、ribonucleotideの三リン酸塩、DTTおよびマグネシウムを含んでいるバッファシステムを含んでいる浄化された線形DNAのテンプレートを必要とする

Transfection方法

eukaryoticセルに外国DNAを導入するさまざまな方法がある。 多くの材料は3種類に分けることができるtransfectionのためにキャリアとして使用された、: (カチオンの)ポリマー、liposomesおよびnanoparticles。

最も安い(および最少の信頼できる最初に1973年にF.L.グラハムおよびA.J. van der Ebによって検出されるカルシウム隣酸塩によって)方法の1つtransfection、行う[必要とされる参照] ([1]また見なさい)。 隣酸塩イオンを含んでいるHEPES緩衝された塩解決(HeBS)はtransfectedべきDNAを含んでいるカルシウム塩化物の解決と結合される。 2つが結合される場合、正荷電カルシウムおよび負荷電の隣酸塩の良い沈殿物は形作り、表面でtransfectedべきDNAを結合する。 沈殿物の中断はtransfectedべきセルにそれから追加される(通常単一層で育つ細胞培養)。 完全に理解されないプロセスによってセルは沈殿物の、そしてそれとのいくつかを、DNAとる。

他の方法は非常にDNAを結合し、セルに得るのにブランチされた有機化合物、いわゆるdendrimersを、使用する。 非常に効果的な方法はliposomes、すなわちセルの構造にいろいろな方法で類似して、セル膜によって実際に溶けることができるセルにDNAを解放する小さい、膜区切られたボディでtransfectedべきDNAの包含である。 eukaryoticセルのために、脂質陽イオンは基づくtransfectionもっと普通セルがより敏感であるので、使用される。

もう一つの方法はDEAEデキストランまたはpolyethylenimineのようなカチオンポリマーの使用である。 負荷電DNAはpolycationに結合し、複合体はendocytosisによってセルによってとられる。

transfectionへの直接的な取り組みはDNAが標的細胞の核に直接「撃たれる」不活性の固体(一般に金)のnanoparticleにつながれる遺伝子銃である。 DNAはまたキャリアとしてウイルスを使用してセルに導入することができる。 このような場合、技術はウイルスのtransductionと呼出され、セルは変換されると言われる。

transfectionの他の方法はLipofectamineのようなnucleofectionが、electroporation、熱の衝撃、magnetofectionおよび専有transfectionの試薬、Dojindo Hilymax、Fugene、jetPEI、EffecteneまたはDreamFect含まれている。

馬小屋対一時的なTransfection方法

transfectionのほとんどのアプリケーションのために、それはtransfected遺伝子がただ一時的に表現されれば十分である。 transfectionプロセスで導入されるDNAが通常核ゲノムに挿入されないので、外国DNAは後期でセルが有糸分裂を経るとき失われる。 transfected遺伝子はセルおよび娘セルのゲノムに実際に残ることが望まれれば、安定したtransfectionは発生しなければならない。

これを達成するため、もう一つの遺伝子はセルに選択の利点を与えるある特定の毒素の方の抵抗のようなcotransfectedである。 transfectedセルのいくつかは(非常に少数)ゲノムに、思いがけなく、外国の遺伝物質を挿入してしまう。 cotransfected遺伝子が抵抗を提供する毒素が細胞培養にそれから追加されれば、ゲノムに挿入された外国の遺伝子が付いているそれらの少数のセルだけが増殖できる他のセルは停止するが。 この選択圧力をしばらくの間適用した後、安定したtransfectionを用いるセルだけ残り、更に耕すことができる。

安定したtransfectionのための共通のエージェントはGeneticin、ネオマイシンの抵抗力がある遺伝子の製品によって中和することができる毒素の別名G418である。

生体外のトランスクリプションは促進者、ribonucleotideの三リン酸塩、DTTおよびマグネシウムを含んでいるバッファシステムを含んでいる浄化された線形DNAのテンプレートを必要とする

Transfectionのためのヒント

• 使用のRNAseの抑制剤常に!
• T7 RNAのバクテリオファージのポリメラーゼが付いているセービングのお金: Nターミナルを持つクローンは彼の6札使用できる。 このクローンを得れば、高い作業(refの多量のT7ポリメラーゼを浄化できる: 彼B、Rong M、Lyakhov D、Gartenstein H、ディアズG、Castagna RのMcAllisterの重量、Durbin RK。 蛋白質Expr Purif。 1997年、9、142-151)。
• DNAのテンプレートを除去するためには、RNAse自由なDNAseを使用しなさい。 私達は15分の間追加されるRQ1 DNase (Promega)を使用し、よく働く。 

Trasfectionの試薬の保存

• RNAはEDTAとの中立pHで最もよく保存される。
• TEバッファはこれが自由に浄化されるRNAseと準備されるべきであるどんなに、(10のmM TrisHCl、pH 7.5、1つのmMのEDTA)推薦される(preferablly Millipore水)。

トラブルシューティングのTransfection問題

壊れるTransfections

• 古いtransfectionの試薬
• 不適当に保存されたtransfectionのエージェント
• 低質DNAかベクトル
• 不十分なDNA量
• 不十分なtransfectionの試薬
• たくさんのDNA
• たくさんのtransfectionの試薬

Transfectionの参照

Transfectionの参照

1. Bacchetti S、グラハムF (1977年)。 「浄化された単純ヘルペスウイルスDNAによるチミジンのキナーゼ不十分なヒト細胞へのチミジンのキナーゼのための遺伝子の転送」。 Proc各国用のAcad Sci米国74 (4): 1590-4年。 PMID 193108。