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高品質を得て、そのままなRNAは北の分析、ヌクレアーゼの保護試金、マップするRT-PCR、RNA生体外の変換およびcDNAライブラリ構築を含む多くの基本的な分子生物学の実験の、実行の最初そして頻繁にクリティカルステップである。 しかしRNAの隔離プロシージャ正常であることは実際のRNAの浄化の前後にある重要なステップを両方含むべきである。
得られるべきRNAによってそれが蛋白質、DNAおよび脂質のような他の細胞材料から隔離されるようにするRNAの特性がある。
メッセンジャーRNAかmRNAは多の形で伸張のアデノシンの残余を含んでいる(A)テール。 これはmRNAが多に区切られるように開発された(T)アフィニティー・カラムかビード。
現在RNAを隔離するための好まれる方法を有したら、それを使用し続けなさい。
および有機体が次のリストにない前にシステムからのRNAを隔離しなかったら、私達は北しみが付くことのためのRNAかシステムからのRT-PCRを隔離するために使用された確立されたプロトコルを識別するのを助けてもいい。 これらのタイプのプロトコルはまた「マイクロアレイ等級」のRNAをもたらす。
品質を査定するためにRNAのagaroseのゲルを常に実行しなさい。
注: 私達が二回目沈殿させるRNAをエタノールからのまたは推薦するか、TRIzolのようなコラムによって基づく浄化の試薬を非使用すればRneasyのコラムか同じような装置を通してそれを渡す。 これはすべての有機性汚染物の取り外しを保証する(次スペクトルを見なさい)。
効率的な核か細胞質分別はagaroseのゲルの分析の変化によってすぐに査定することができる(図1)を見なさい。 前駆物質のrRNAに対応するバンドは総および核RNAの一部分で同等べきである。 18Sおよび28S rRNAバンドは合計のRNAまたは細胞質一部分のRNAのより核RNAの一部分でより少なく強い。 あるセルライン、例えば293およびCOS-7セルでは、この相違は劇的であるが、ヒーラセルのような他のセルラインに、rRNAバンドは総か細胞質一部分のRNAのより核RNAでほんの少しだけより少なく強い。「
A260読書および比率260/280は高い純度のRNAを保障する十分ではない。 完全な紫外線スペクトルを取らなければならない。 すべてに比率よい260/280があるが次あったり、非常に異なった純度がある3本の例スペクトルに。 またRNAの有機性汚染の量を定めるのを助けるのに260/230の比率を使用できる。 それは260/280の比率よりはるかに可変的な番号であるが、一般に、1の上の比率はよい純度を示す。
セルはPBSでそれから洗浄され、記述されているように引き続いて得た。 最初に、セルはNonidet P-40バッファ(10のmM、(pH 7.5)と、10のmM、MgCl2 NaCl TrisCL 3つのmM、0.5% (v/v) Nonidet P-40の、40 units/ml Rnasin、1つのmM DTT)得られた。 残りの餌(荒い細胞質網状質(RER)および核)は同じバッファで洗浄され、バッファB (10のmM (pH 7.5)で、NaCl TrisCL 10のmM、0.5% (v/v) Nonidet P-40の、40のmMのEDTA、40 units/ml Rnasin、1つのmM DTT)得られた。 残りの核餌は同じバッファで洗浄され、高い塩バッファ(10のmM (pH 7.5)と、0.5 M NaCl、MgCl2 TrisCL 3つのmM、0.5% (v/v) Nonidet P-40の、40 units/ml Rnasin、1つのmM DTT)得られた。 RNAはRNA STATの解決によって各一部分から浄化された。 総RNAはRNA-STAT60試薬を使用して製造業者によって提供された命令に従って(Telテスト)隔離された。 (参照: 等ByeongChurl Jang、2002年)
100つのmlsのため200のmls
4. 5M Guanidiniumのチオシアン酸塩53.2 g 106.4 2% N-lauroylsarcosine (sarcosyl) 2.0g 4.0g 50mMのEDTA 0.5M 10 mls 20のmls 25mM TrisHCl、pH 7.5 1M 2.5のmls 5つのmls
0。 1Mのbmercaptoethanol 700ul 1.4mls
0。2%のantifoam A (シグマ) 200 ul 400 ul
5. 7つのM CsClのcushion*の最終的なボリューム100つのml
5. 7つのMはCsCl 95.8gを「焼いた」
0。 1MのEDTA 0.5M 20のmls
*使用DEPCは水を扱い、ガラス製品を焼いた。 この解決は、絶対に、肯定的に自由にRnaseなる。 Rnaseはどこでもある! 摩耗の手袋は、焼かれたガラス製品、か無穿孔プラスチックだけ使用する。 DePCの御馳走水、バッファ(Trisを除いて)。 非常に注意しなさい。
1.動物の重量を量りなさい。 器官(レバー)を除去しなさい、cDNAの優秀な属性の1つをある減らすmultilocusの酵素の単一の位置だけを表現する器官の選択によって遺伝子の複雑さを重くしなさい。 2. Homogenantが4Aを回している間不溶解性材料4.を取除くために「無秩序」バッファ(9mls) 12のKGでhomogenant 3.回転でティッシュを急速に均質にしなさい。 サンプルごとのCsCl (0.2g/ml)の1.8 gを重くしなさい。 4B. 超遠心分離機の管(「速シール」)で5.7M CsCl 「クッションの3.5mlsを追加しなさい」この層が自由にRnaseなる。 この層によってRNAを遠心分離機にかけ、どの汚染により重要な損失を引き起こす。 5. supernant、新しい管に入れられて除去しなさい、1.8 g CsCl 6.を注意深く追加しなさい、CsClのクッションの上にhomogenant追加しなさい。 これは10ccスポイトおよび長い針の使用によって最も容易に堪能である。 速シールの管への場所の針かスポイトはスポイトに、およびhomogenantティッシュを追加する。 Homogenantはクッションの上に浮かぶQ-Sの管にゆっくりしたたる。
7.注意深く、遠心分離機管のバランスのマッチペア(+0.005 g)。
8.シール管、場所は赤いアルミニウム上に互いおよび帽子の管の反対をマッチさせた。
9.遠心分離機、50,000のrpms 5.5 hrs、20oC
遠心分離の後: 餌が下記のとおりであるべきであるところマークの管: 最下の外の側面(回転子の中心に関連して)
10.管、便利なラックの場所を除去しなさい。
11.管の上を離れてスライスしなさい。解決の最初の2/3- 3/4を離れて吸い出しなさい。 作業トップダウン方式で。 甲革を離れてほとんどの解決を最初に吸い出し、すべて明確なクッションを除去することは重要である。 底で見えない餌を吸い出してはいけない。
12。 管の最初の2/3を断ち切りなさい。 「引っ張られた」Pasteurを使用して残りの解決をピペットで移しなさい、注意深く除去しなさい。 餌は管のbottom-sideにある。
13。 70% EtOHの洗浄の餌は、(使用Pasteurはピペットで移す)、二度繰り返し除去する(合計3は洗浄する)
14。 クラッシュの餌および解決に餌を入れるT.E.の試みを「滴定すること」にピペットで移の先端を使用して0.1x TE (自由なRNase)の200 ulを、追加しなさい。 少なくとも異質解決を形作り、新しいmicrofugeの管に入れなさい。
15。 両方の解決を分かち合うT.E.の200 ulとの繰り返し
16。 渦は、よいRNA解決に入るのを好まない。 忍耐は美徳である。
17。 集中を、490 ulへの10 ul定めなさい(500 ul最終的なVol.)
18。 ゲルの分析のためのRNAの1から2 ugを取除きなさい(RNAのローディングバッファを追加しなさい)
19。 1/10のボリュームRnase 3M NaOAC (40 ul)、EtOH (1.0ml)の2.5ボリュームを自由に追加しなさい。 活発の組合せ。
20。 そこにであるRNAすべてをすぐに沈殿させる必要性EtOH.ThusのRNAの集中を計算できない。 ちょうどあなたがEtOH/RNAの解決をvortexingによって必要とする取除き、適切なボリュームを取除きなさい量を約1.5から2倍の。 20oCで保存されるこのEtOH/RNAの解決はまたは幾年もの間安定している下がったり。
見なさい:
