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ない結果が、Archimedes の浴室及びニュートンのりんごの落ちた古生物学者のアンドリューの丘によって、[ 偶然に一致させる3.6 百万年古い] 化石の足跡結局1 夕方1976 年9 月気づかれたら、ある意味では、西部生態学者がデイヴィッド彼で投げつけた象の肥料の球を避けている間。~John の読取装置、抜けたリンク: 最も早い人のためのハンチング
ハイクオリティを得て、そのままなRNA は北の分析、ヌクレアーゼの保護試金、RT-PCR 、マップするRNA インビトロ変換およびDNA ライブラリを含む多くの基本的な分子生物学の実験の、実行の最初そして頻繁にクリティカルステップ構築である。しかしRNA の分離プロシージャ正常であることは実際のRNA の浄化の前後にある重要なステップを両方含むべきである。
得られるべきRNA によるそれが蛋白質、DNA および脂質のような他の細胞材料から隔離されるようにするRNA の特性がある。
メッセンジャーRNA かmRNA はpoly(A) の尾の形で伸張のアデノシンの残余を含んでいる。mRNA がpoly(T) のアフィニティー・カラムかビードに区切られるようにこれは開発された。
現在RNA を隔離する為の好まれた方法を有したら、それを使用し続けなさい。
及び有機体が次のリストにない前にシステムからのRNA を隔離しなかったら、私達は北にしみが付くことのためのRNA かシステムからのRT-PCR を隔離する為に使用された確立されたプロトコルを識別するのを助けることができる。これらのタイプのプロトコルはまた"microarray 等級" のRNA をもたらす。
常に品質を査定するためにRNA のagarose のゲルをランしなさい。
注: 私達が二回目沈殿させるRNA をエタノールからのまたは推薦するか、TRIzol のようなコラムによって基づかせている浄化の試薬を非使用すればRneasy のコラムか同じような装置を通してそれを渡す。これはすべての有機性汚染物の取り外しを保証する(スペクトルを次に見なさい) 。
有効なnuclear/cytoplasmic の分別は変化のagarose のゲルの分析によってすぐに査定することができる(図1) を見なさい。前駆物質のrRNA に対応するバンドは総及び核RNA の一部分で同等のべきである。18S 及び28S rRNA バンドは合計のRNA または細胞質一部分のRNA のより核RNA の一部分でより少なく強い。あるセルライン、例えば293 及びCOS-7 セルでは、この相違は劇的であるが、ヒーラセルのような他のセルラインに、rRNA バンドは総か細胞質一部分のRNA のより核RNA でほんの少しだけより少なく強い。"
A260 読書及び比率260/280 は高い純度のRNA を保障する十分でない。完全な紫外線スペクトルを取らなければならない。の下ですべてに比率よい260/280 があるがあったり、非常に異なった純度がある3 本の例スペクトルに。また定めるRNA の有機性汚染の量をヘルプへの260/230 の比率を使用できる。それは260/280 の比率よりはるかに可変的な番号であるが、一般に、1 の上の比率はよい純度を示す。
セルはPBS でそれから洗浄され、記述されているように引き続いて得た。最初に、セルはNonidet P-40 バッファ(10 ミリメートル、(pH 7.5) と、10 ミリメートル、MgCl2 NaCl Tris CL 3 ミリメートル、0.5% (v/v) Nonidet P-40 の、40 units/ml Rnasin 、1 ミリメートルDTT) 得られた。残りの餌(荒い細胞質網状質(RER) および核) は同じバッファで洗浄され、バッファB (10 ミリメートル(pH 7.5) で、NaCl Tris CL 10 ミリメートル、0.5%(v/v) Nonidet P-40 の40 ミリメートルのEDTA 、40 units/ml Rnasin 、1 ミリメートルDTT の) 得られた。残りの核餌は同じバッファで洗浄され、高い塩バッファ(10 ミリメートル(pH 7.5) と、0.5 のM のNaCl 、MgCl2 Tris CL 3 ミリメートル、0.5%(v/v) Nonidet P-40 、40 units/ml Rnasin 、1 ミリメートルDTT の) 得られた。RNA はRNA のSTAT の解決によって各一部分から浄化された。総RNA はRNA-STAT60 試薬を使用して製造業者によって提供された命令に従って(電話テスト) 隔離された。(参照: Byeong-Churl Jang 等、2002)
100 つのmls のため200 のmls
4 。sarcosyl) 2.0g 4.0g 50mM 5M Guanidinium のチオシアン酸塩53.2 g 106.4 2% N-lauroylsarcosine の(EDTA 0.5M 10 のmls 20 のmls 25mM Tris-HCl のpH 7.5 の1M 2.5 のmls 5 つのmls
0 。1M のb b-mercaptoethanol 700ul 1.4mls
0 。(シグマ) 2% のantifoam A 200 のUL 400 のUL
5 。7 つのM CsCl のクッション* 最終的なボリューム100 ML
5 。7 つのM はCsCl 95.8g を"焼いた"
0 。1M のEDTA 0.5M 20 のmls
* 使用DEPC は水を扱い、ガラス製品を焼いた。この解決は、絶対に、肯定的にRnase 自由になる。Rnase はどこでもある! 摩耗の手袋は、焼かれたガラス製品、か無穿孔プラスチックしか使用しない。DePC の御馳走水、バッファ(Tris を除いて) 。非常に注意しなさい。
1 。動物の重量を量りなさい。器官(レバー) を除去しなさい、DNA の優秀な属性の1 つをある減らすmultilocus の酵素の単一の位置しか表現しない器官の選択によって遺伝子の複雑さを重くしなさい。2 。"無秩序" バッファ(9mls) でティッシュを3 急速に均質にしなさい。不溶解性材料4 を取除くために12 キログラムでhomogenant 回しなさい。Homogenant が4.A を回している間。1 サンプルにつきCsCl (0.2g/ml) の1.8 g から重くしなさい。4B. 超遠心分離機の管("速シール") で5.7M CsCl "のクッション3.5mls を追加しなさい" この層がRnase 自由になる。この層によってRNA を遠心分離機にかけ、どの汚染により重要な損失を引き起こす。5 。supernant 、新しい管に入れられて除去しなさい、1.8 g CsCl 6 を追加しなさい。注意深く、CsCl のクッションの上にhomogenant 追加しなさい。これは10cc ス�&イトおよび長い針の使用によって容易に堪能である。needle/syringe を速シールの管に置き、ス�&イトにhomogenant ティッシュを追加しなさい。Homogenant はクッションの上に浮かぶQ-S の管にゆっくりしたたる。
7 。注意深く、遠心分離機管のバランスの一致させたペア(+ 0.005 g) 。
8 。シール管、場所は赤いアルミニウム上に互い及び帽子の管の反対をマッチさせた。
9 。遠心分離機、50,000 のrpms 5.5 時間、20oC
遠心分離の後: 餌が下記のとおりであるべきであるところマークの管: 最下の外の側面(回転子の中心に関連して)
10 。管、便利なラックの場所を除去しなさい。
11 。解決の最初の2/3- 3/4 を離れてtube.Aspirate の上を離れてスライスしなさい。上から働かせなさい。甲革を離れてほとんどの解決を最初に吸い出し、すべて明確なクッションを除去することは重要である。底で見えない餌を吸い出してはいけない。
12 。管の最初の2/3 を断ち切りなさい。"引っ張られた" Pasteur を使用して残りの解決をピペットで移しなさい、注意深く除去しなさい。餌は管の底側面にある。
13 。70% EtOH の洗浄の餌は、(使用Pasteur はピペットで移す) 、二度繰り返し除去する(合計3 は洗浄する)
14 。クラッシュの餌及び解決に餌を入れるT.E. の試みを"titrating" にピペットで移の先端を使用して0.1x TE (自由な) のRNase 200 のUL を、追加しなさい。少なくとも異質解決を形作り、新しいmicrofuge の管に入れなさい。
15 。両方の解決を分かち合うT.E. の200 のUL の繰り返し
16 。渦は、よいRNA 解決に入るのを好まない。忍耐は美徳である。
17 。集中、490 のUL (500 のUL 最終的なVol.) への10 のUL を定めなさい
18 。ゲルの分析のためのRNA の1 から2 ug を取除きなさい(RNA のローディングバッファを追加しなさい)
19 。1/10 のボリュームRnase 3M NaOAC 、EtOH (1.0ml) の2.5 ボリュームを自由に追加しなさい(40 のUL) 。活発の組合せ。
20 。そこにであるRNA のすべてをすぐに沈殿させる必要性EtOH.Thus のRNA の集中を計算できない。ちょうどあなたがEtOH/RNA の解決をvortexing によって必要とする取除き、適切なボリュームを取除きなさい量を約1.5 から2 倍の。20oC で保存されるこのEtOH/RNA の解決はまたは幾年もの間安定している下がったり。
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