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分子生物学Blog

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北のしみ

版権2007 年- 分子端末

可聴周波 詳しい北のしみの説明を聞きなさい!

北にしみが付くことの歴史

北にしみが付くことはスタンフォード大学(ref:1) のAlwine 等によって1977 年に開発されたRNA のしみが付く技術である。それはDNA のためにしみが付く Edwin M. Southern によって発明された南しみの技術の名にちなんで1975 年に名付けられた。 西部のしみは、蛋白質のためにしみが付く方法指名する南しみの演劇また、1981 年に指名された(ref:2) 。

基礎的な情報- 北のしみの技術

実時間PCR 、ヌクレアーゼの保護試金(RPAs) およびmicroarrays のハイテクの世界の年齢にもかかわらず北の分析は、mRNA のレベルの検出そしてquantitation のためのまだ金標準である。これは北のしみの分析が単一の膜のサンプル間のメッセンジャーRNA の豊富の直接比較を可能にするのである。

北のしみで他のしみが付く技術間の主要な相違はRNA が検出される要因であることである。また、RNA が通常単一座礁するという事実のために、それは移行に影響を与え、それ故に条件を変化させてゲルをランするのに使用されている複雑な二次構造を作成する(南とは違って) 。

RNA はRNA のゲルの電気泳動( 通常agarose のゲルの 電気泳動) 、膜へのそれに続く転送、プローブとの交配、および最終的に検出によって分かれている。

 

 

南にしみが付くことに同様に、交配のプローブは北にしみが付くことのDNA またはRNA であるかもしれない。

逆の北のしみとして知られていたプロシージャの変形は時折(が、まれに) 使用された。このプロシージャでは、核酸隔離されたDNA のフラグメントのコレクション、およびプローブの(膜に添付される) 基板はティッシュから得られ、放射能によって分類されるRNA である。

90年代後期および早い2000s の広まった使用に入って来たDNA のmicroarrays の使用はそれらが基板に添付される隔離されたDNA のフラグメントの使用を含むこと細胞RNA からなされるプローブとの逆プロシージャ、および交配と同類である。従って側面図を描く有機体の遺伝子の多数に(多分すべて) 監視される表現があるかもしれない遺伝子表現に展開する北の分析を使用して遺伝子表現の1 時間調査可能になる最初に珍しいけれども逆プロシージャ、

北のしみのアプリケーション

北のしみは実時間PCR およびmicroarray アプローチによってほとんどの領域でsuperceded あった。それは頻繁に臨床か診断目的のために使用されない。

北のしみのプロトコルおよび変化は分子生物学の研究でしかし使用される:

• mRNA (メッセンジャーRNA のコピー) のレベルの遺伝子表現の直接調査のための金標準。
• mRNA のコピーのサイズの検出
• 調査のRNA の劣化
• 調査のRNA の接続- 代わりに接続されたコピーを検出するできる
• RNA の半減期を調査しなさい
• 調査の怒り(内部ribosomal エントリサイト) - 第2 cistron の変換対RNA の消化力の可能性を除去するため。
• 頻繁にtransgenic/ノックアウトマウス(動物) を確認し、点検するのに使用した

北にしみが付くことの不利な点

北にしみが付くことの使用の不利な点は下記のものを含んでいる:

• 頻繁に放射能は使用される。これはそれ、使用および処分を行う容易さを防ぐ。非放射性検出の新しい方法は生成され非放射性検出を許可する。ピアースに会いなさい。
• 北にしみが付く全プロセスは検出にサンプル準備からの長い時間を、通常かける。
• わずかにRNases が低下させるRNA のサンプルが均一なら表現のデータそしてquantitation の品質はかなり否定的に影響を受けている。
• 標準北のしみ方法はヌクレアーゼの保護試金及びRT-PCR より比較的より少なく敏感である。北のしみの感度はナイロンpositively-charged 膜の使用、非常に特定のantisense のプローブの使用と高められるかもしれない。
• 多重プローブとの検出は問題である。頻繁に、膜は第2 プローブとの交配そして検出の前に除去されなければならない。これはしみからプローブを除去するために粗い条件が必要となり、また時間のかかるので問題である。また、しみが除去されるかもしれない時間へ限界がある。

北にしみが付く利点

北のしみの利点は下記のものを含んでいる:

• それは広く受け入れられ、よく見なされた方法である
• 北にしみが付くことは簡単な方法である
• 頻繁にそれは確認か点検として使用される
• 頻繁に金標準
• それは多くのタイプのプローブの(実時間PCR 対) 下記のものを含んでいることの使用法を可能にすることができるので多目的なプロトコルである: プライマーのようなradiolabeled 及び非non-radiolabeled 、インビトロ転写されたRNA そしてオリゴヌクレオチド。
• 実時間PCR または他の方法とは違う部分的な相同を用いるシーケンスは、交配のプローブことができる(相同の分析のための異なった種類からのすなわちシーケンスは、またはgenomic フラグメントとして使用することができる) 使用する。

北のしみのプロトコル

述べられてように北にしみが付くことのステップは下記のものを含んでいる:

1. RNA の分離
2. 分離のためのRNA のゲルの電気泳動
3. 膜への転送(RNA として通常positively-charged ナイロンはnegatively-charged である)
4. 膜へのRNA のCross-linking (通常紫外線架橋結合するか、または化学薬品の平均によって)
5. 交配
6. 検出

材料は北のしみのプロトコルのために必要とした

バッファ調理法

20XSSPE (500 ML)

• 3.6M のNaCl: 105.2 g
• 0 。2M の隣酸塩バッファpH 7.0: 1M の100mL
• 20mM のEDTA: 0.5M の20mL

隣酸塩バッファpH7.0 (500ml)

• NaH2PO4 (一塩基) 140 ML の1M
• Na2H2PO4 (二塩基の) 360 ML の1M
• 両方の後の7.0 へのpH は追加される

交配バッファ= HB (100mls)

• 5X SSPE: 25mls 20X
• 2% SDS: 20 のmls 10%

 

* * 前にを使用して右1000ug によって変化させるRNAse ct のDNA (変化するべき3 分の95.o への熱) の5000ug イーストRNA を自由に追加しなさい

 

洗浄: 2X SSPE + 0.1% SDS (500 のmls) 50 のmls 20X 5 のmls 10% SDS = 0.1% SDS

RNA のゲル(1L) のための連続したバッファ

• 100 つのmls 10X は拭く
• 52 。ホルムアルデヒドの6 つのmls
• 847 。4 つのmls H20

RNA のゲル(70ml)

• 0.84 g のagarose
• 7 つのmls 10x は拭く
• 58.38 のmls H2.O
• 暖房によって解決にゲルを置きなさい。60.C に涼しいゲルを許可しなさい次に同輩にホルムアルデヒドを0.66M -- 3.78 のmls 追加しなさい
• 可能なら発煙のフードのゲルを注ぎなさい

北のしみのためのRNA のサンプル

RNA の 分離及び浄化を見なさい

RNA のゲル

RNA を隔離した後、RNA はゲル(通常agarose) で分かれていなければならない。

RNA の ゲルを見なさい

ナイロン膜のプロトコルへの北のしみの転送

RNA のゲルを ランした後、posiblotter に置かれる蒸溜された水が付いているゲルを洗浄しなさい。

上からの底への層は次のとおりである:

• ス�&ンジ
• 3-4 サイズへのWhatman のペーパー切口(両方上りの上記は10X SSPE 滴らないことで浸るべきである)
• ゲルマスク。
• 注: ゲルの上のラインが付いている膜を密封でき、右の上のコーナーが穴が付いているわずかにより大きい3M ペーパー堅いプラスチック3 部分の示したようにマスクゲルオーバーレイは確かめる

クランプはよいシールがあることを確かめ。1 時間または多く圧力の使用75-80 ミリメートルヘクトグラム。

乾燥したしみの膜

Cross-linking のナイロン膜- 北のしみのプロトコル

• saran 覆いの右上隅の覆いを切りなさい。
• 紫外線2.5 分の間RNA の側面と照射しなさい。
• 熱い2X SSPE/0.1% SDS の解決(50% 力の幾つかの分の間の30-45 秒のマイクロウェーブ解決洗浄しなさい。
• 乾燥した乾燥しなさい

北のしみのための前に交配

1. 前に6 時間夜通しの間交配させなさい
2. 解決にSDS を置くために65.C 熱HB バッファにオーブンをセットしなさい
3. 網の部分の中の膜を転がし、hybridizaton tube(2X SSPE/0.1%SDS に入れなさい)
4. 空気泡があるように確認しなさい
5. 反対側に別の管によってバランスをとられるオーブンに管を置きなさい

北にしみが付くことのための分類のプローブ

1. ddH2.O の11uL の総ボリュームにプローブの25ng を置きなさい
2. @ 95.C を3 分変化させなさい。これはプローブに単一の座礁させる得、有効な交配を防ぐ二次構造を除去するために行われる。
3. 速くぬれた氷で冷却しなさい。これはプローブの単一の座礁させる、二次構造の自由保ち、割り当てないために行われる(reannealing または二次構造の改良することを) 。
4. 4.ul 高く主な(Boehringer Mannheim) 5.ul アルファのradiolabeled P-32 dCTP 3000uCi/mmole 20ul 合計を追加しなさい
5. 10-15 最低の37.C をIncubate
6. 20ul 反作用に1X TE の2.ul 0.5M のEDTA の28uL を、追加しなさい。
7. 1 分のためのG-25 セファデックスのコラムを前回しなさい。
8. 50ul サンプルをコラムに追加し、臨床遠心分離機の2.5 分の間回しなさい。これはラベルからのプローブを浄化するために行われる。
9. 投球のコラム。
10. 0.5mL 管の新しい管100ug CT-DNA 50ug のイーストRNA の組合せ。
11. 95. を3 分変化させなさい
12. ハイブリッド管の組合せに追加しなさい、20-36 時間65.C で交配させなさい

北にしみが付くことのための交配のプロトコルを掲示しなさい

36-48 時間それから洗浄する交配させなさい。

1. 65. C まで2X SSPE/0.1% SDS の熱の上で(洗浄) 熱しなさい(解決を暖める使用マイクロウェーブまたは水浴室)
2. 管を取り、熱い放射性廃棄物の容器に液体を注ぎなさい。
3. 10ml 洗浄が付いている洗浄はこれを二度し、無駄を注ぐ。
4. 洗浄及び振動の40 から50 のmls にvigoursly 置かれる。
5. 20 最低の回転のための交配のオーブンに置かれる。
6. 流しの下で注ぎなさい
7. オーブンの別の40-50mls そして振動。
8. 熱くか有毒便器(流し) に注ぎ、確かめなさいもはや熱くなく、次に膜を取ることを。
9. 15 分のRT で0.1% SDS との0.2XSSPE のシェーカーで洗浄しなさい。
10. 乾燥した乾燥しなさい
11. 暴露

 

北のしみのためのヒント

現在RNA を隔離する為の好まれた方法を有したら、それを使用し続けなさい。

常に品質を査定するためにRNA のagarose のゲルをランしなさい。しか分光測光の結果に頼ってはいけない。

* DEPC によって扱われる水および焼かれたガラス製品を使用しなさい。この解決は、絶対に、肯定的にRnase 自由になる。Rnase はどこでもある! 摩耗の手袋は、焼かれたガラス製品、か無穿孔プラスチックしか使用しない。DePC の御馳走水、バッファ(Tris を除いて) 。非常に注意しなさい。

 

修理の北のしみ

現在RNA を隔離する為の好まれた方法を有したら、それを使用し続けなさい。

 

北のしみのフォーラムのこれについての質問を 論議し、掲示しなさい。

北のしみの参照

1. Alwine JC 、Kemp DJ 、硬直したGR (1977 年) 。"agarose の特定のRNAs の検出のための方法diazobenzyloxymethyl ペーパーへの転送によってゼリー状になり、DNA との交配は" は厳密に調べる。Proc 。各国用。Acad 。Sci 。米国. 74 (12): 5350-4 。
2. W. Neal Burnette (1981 年4 月) 。"' 西部にしみが付くこと': ナトリウムdodecyl 硫酸塩の�&リアクリルアミドゲルからの非修飾硝酸セルロース — への蛋白質および抗体とのレントゲン写真の検出の電気泳動の転送は及び蛋白質A を"radioiodinated 。肛門のBiochem 112 (2): 195-203 。