第2二次元のゲルの電気泳動

SDSゲルを通したすべての細胞蛋白質の電気泳動はそれ容易に同じような重量を(52-kDA蛋白質からの例えば53-kDA蛋白質)持っている蛋白質を解決できない分子量で比較的大きい相違を持っている蛋白質を分けることができるしかし。

1Dゲルの電気泳動方法では、蛋白質は(大容量だけで分かれているである)で1つの次元分かれている。

しかし第2電気泳動では、分離は1-D電気泳動からそこにである起こる初めから方向の充満で蛋白質を90度分ける第2分離始まる。

結果はanalytesがラインに沿うよりもむしろ二次元の表面を渡って広がることである。 従って複数の蛋白質が第2ゲルの点があった1つにあることは、蛋白質が多くだけでまた充満で分かれていないが、という事実、原因でまずない。 これは2つの蛋白質は同じ厳密な大容量だけまた同じを充満共有することはまずないのである。

従って、第2ゲルで、analytesは充満でより第2分離のステップによる1-D電気泳動の第2電気泳動でもっと効果的に分かれている。

同じような大容量の蛋白質を分けるためには、蛋白質の別の物理的特性は使用されなければならない。 分離で使用されるかもしれないもう一つの重要で物理的な蛋白質の特性は蛋白質およびグループ充満の酸性および基本的な残余の番号によって定められる充電である。

同じような大容量を持っている2つの無関係な蛋白質はアミノ酸シーケンスが異なって、こうして酸性および基本的な残余の充満そして番号が別の純充満を与えるので同一の純充満を持ってまずない。 これはこれらの蛋白質が第2、ない1-Dゲルの電気泳動で分かれているようにする。

第2ゲルの分離法では、蛋白質は等電ポイント実際に分かれている(等電ポイント(pIは)特定の分子か表面が純充電を。運ばない) pHである。

pHの勾配はゲルに適用され、電気潜在性は1つの端を他より肯定的にさせるゲルを渡って応用である。 等電ポイントよりすべてのpHsのaotherで、蛋白質は満たされる。 正荷電なら、ゲルのより否定的な端の方に引っ張られ、負荷電ならゲルのより肯定的な端に引っ張られる。 しかしそれらが等電ポイントに相当してpHのゲルの領域に達すればneutraly満たされるようになり、その点に残る。

二次元の電気泳動のための蛋白質の検出のプロトコル

分離の後で、蛋白質は第2ゲルで肉眼に見えないがありなさいどんなに、分かれている。 ゲルの蛋白質を視覚化するためには、蛋白質の非常に敏感な汚損および検出方法は遂行されなければならない。

これは複数の事実が原因である:

1. ゲルの車線はある特定のボリュームだけのセルlysateまたは蛋白質の解決を受け入れることができる。
2. より多くの蛋白質をロードするためにlysateか解決が沈殿し、集中することができるが通常より少ない蛋白質は第2ゲルで余分な蛋白質量が大きい点サイズによるゲルを分析することを困難にすると同時にロードされる。
3. 多量の蛋白質(mgs)の分離、また更にたくさんの比較的大きい2 dimensionsionalのゲルへの1つの小さい車線からの異なった蛋白質は、非常に低いabudance/集中である蛋白質の点を生成する(NGかpicograms!) それは通常の汚れか蛋白質の検出方法によって検出しが不可能またはにくい。
4. 低い豊富/低は限定番号蛋白質分けることができるが最も敏感な汚れに約1/2の検出限界だけがnanogramあるという事実が検出された原因ではないかもしれない。 Picogramの点のレベルは現在汚損と検出しが非常ににくくまたは不可能である。

従って第2電気泳動では、非常に敏感な汚れは必要となる。 これらの蛋白質はいろいろな平均によってそれから検出することができるが共通は銀の汚損およびcoomasieの汚れである。

銀製の汚損の第2ゼリー状になる

第2ゲルの銀製の汚損で、銀製のコロイドはゲルに加えられる。 銀は蛋白質内のシステインのグループと結ぶ。 銀は紫外線への露出によってそれから暗くなる。 従って点の銀の暗闇は銀の量およびゲルのある特定の位置の蛋白質の量と、関連していることができる。 この測定はおおよそ量だけを与えることができるがほとんどの目的のために十分である。

第2のCoomasieの汚損はゼリー状になる

Coomassieの染料は芳香のアミノ酸、アルギニンおよびヒスチジンのようなアミノ酸にphysisorptionによって蛋白質に結合する。 Coomasieはブラッドフォード方法でも使用される。 蛋白質の1 NG以下含んでいる点の視覚化を可能にする敏感で無毒なcoomasieの汚れは生成された。

第2のSYPROの汚損はゼリー状になる

SYPROのルビーは非常に敏感な第2蛋白質の検出方法の汚れであり、蛋白質のNG約1/2の視覚化にある特定の点で与える。 従って不利な点は方法汚れを視覚化するように要求し紫外線がであり紫外線の使用法を必要とする。 これは点の切断を可能な紫外線露出が困難、に危険を伴う原因でする。

7 cm IPGのための二次元のゲルの電気泳動のプロトコルはAmersham GEの感知を除去する。

第2ゲルのサンプル準備

• 蛋白質のサンプルは通常desaltedである必要があるか、または透析した。 透析は大量のための大きい透析袋と行なうことができるまたは小型は(ピアース)滑るlyzer小さいボリュームのために。
• 透析は0.3mMの1つのLと行なわれたを使用して30分にわたるアンモニウムの重炭酸塩が透析キット(ピアース)を滑らせるlyzer。
• 透析の後で、サンプルは1つの½時間の凍結乾燥機を使用して凍結乾燥した。
• 凍結乾燥させたサンプルは400のl再水和作用バッファとそれから再構成された。

IEFの等電集中

IPGのストリップのステップ1.再水和作用

• drystripの再水和作用のisoelectrofocusing皿はIPGphorのクリーニングの解決(感じるAmersham GE)と注意深くきれいになった。
• サンプルが水路に沿って移行するので皿が乾燥したぬれていないことを確かめなさい。
• 皿の円領域に125のlをピペットで移しなさい。
• ピンセットを使用して、注意深くプラスチック保護装置からIPGのストリップを除去しなさい。
• IPGのストリップにプラスチックcoversheetがあったりまたはゲルの側面を保護することを除去する。 これらのストリップを使用する前に鉗子/ピンセットを使用してこれを除去しなさい。
• 穏やかにサンプルにストリップのゲルの側面を置きなさい。
• 泡を除去しなさい。
• 鉱油皿の車線の端で置き、完全にIPGのストリップをカバーするまで車線をおろす押し確かめなさい。 鉱油オーバーレイが全体のストリップこれが再水和作用の間に蒸発を防ぐように歩む確かめなさい。