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科学は事実である; 家が石から成っているように、事実から成っている科学はそうある; しかし石の山は家でないし、事実のコレクションは必ずしも科学でない。 ~Henri Poincaré
また見なさい: 外部サイトへの関連リンク: 西部のしみ
音声部分: 詳しい西部のしみの説明を聞きなさい! 礼儀: 各国用の人間のゲノムの研究所。
西部のしみ定義: 西部にしみが付くことは特定の抗体に結合する機能に基づいて蛋白質を識別し、見つけるのに使用される技術である。
西部のしみの分析は多数の蛋白質の混合物からの興味の蛋白質を検出できる。 西部にしみが付くことは(kDaのサイズのマーカーへの比較とか梯子)蛋白質のサイズの情報を与えることができ、また蛋白質の表現の情報を与える(未処理のサンプルのような制御への比較とか別のセルタイプまたはティッシュ)。
概要: 西部のしみはの情報を与える:
西部のしみの分析はセルかティッシュから、しかし生体外で総合したまた組換え蛋白質を分析できるかどうか蛋白質のサンプルを分析できる。 西部のしみは細目がこの蛋白質のためそれどのようにであるかあなたが興味の蛋白質のために厳密に調べるのに使用する抗体の品質に依存して。 抗体は今容易に商業ソースから獲得可能であり、興味の蛋白質のための1つを購入できる。 蛋白質が新しい蛋白質なら、抗体をあなた自身作り出すか、または会社をあなたのためのそれをするために得なければならない。 この場合少なくとも少しをセルエキスから浄化されるか、または組換えとしてなされた蛋白質必要とする(生体外または組換え蛋白質の表現システムでie)。 蛋白質に特定の抗体はたくさんの西部のしみの蛋白質の代りに興味の蛋白質にとりわけ結合できるので西部にしみが付くことに重大である!
図1。 西部のしみのための蛋白質の取得にかかわるステップの細部。
図2。 西部のしみを行なうことのステップを詳しく述べる図。
[上]
図表1を次に見なさい。 最初事第1。 あなたが分析したいと思うセルサンプルのような蛋白質のサンプルを得なさい。 蛋白質内容を解放するためにセルを分離させなさい。 サイズに基づいて蛋白質を分けるゲルのこれらをランしなさい。 それから電気を使用して膜にこれらのゲル蛋白質を転送しなさい。 この膜がそれから一次抗体を使用して興味の蛋白質のために厳密に調べるのに使用することができる。
西部のしみを必要とする何:
西部のしみは一次抗体に膜と前にゲルのたくさんの蛋白質からのこの蛋白質を検出するために頼る! (セルは30,000の蛋白質を含み、-これらの同じ蛋白質は変えることができ300,000の蛋白質に!与える)。 抗体を使用して一次抗体(二次抗体)をあなたが蛋白質抗体抗体サンドイッチを造り上げる認識する! 二次抗体に軽い解放の物質にluminolの基板を変換する馬ラディッシュの過酸化酵素の酵素がある! このライトはフィルムの点として検出される。 この点からどの位蛋白質が他の点に関連してそこにある、またはゲルでまたランされるサイズのマーカーかに関連する蛋白質のサイズ定めることができる。
図表2は西部のしみの例のゲルを示す。 車線1は蛋白質の異なった知られていたサイズを示す蛋白質のサイズのマーカーの梯子、これ商業的に購入することができるであり、すべての点のサイズはパンフレットで与えられる。 車線3は癌のサンプルであり、車線5は正常なサンプルである。 見ることができるように車線3の蛋白質に興味深い車線5で癌のサンプルより高い表現がある。 また、車線3および5の蛋白質の点は車線1からのサイズの梯子の第2点同じサイズである。 私達はそれから私達が梯子と受け取った私達のパンフレットからの知られていた蛋白質のサイズを見てもいい。 私達はそれから蛋白質のサイズが80 kDaであることを定める。 興味の私達の蛋白質はまた80 kDaである。 そう私達は西部のしみが働いたこと、そして蛋白質が癌のサンプルに非常に表現されることがわかる!
蛋白質を検出するため:
[上]
[上]
西部のしみのためにできている順序で目録、:
最も最近の西部のしみのトピック!
[上]
- Prepartationを見本抽出しなさい
-バッファを分離させること
-抗体
-セルを分離させること
-準備をゼリー状になりなさい
-ランするゲル
-ゲルの転送
-制御
-西部のしみ
-読み出し
-分析および解釈
[上]
非付着性のセル(Tセルラインか周辺血球のような)または付着性のセルを(繊維芽細胞のセルかCOSのセルのような)有するかどうか、媒体から無関係蛋白質を取除く必要がある。 非付着性のセルのために穏やかに遠心分離とのそれらを小球形にし、次にPBSの餌を洗浄できる。 付着性のセル、簡単な洗浄フラスコまたは西部のしみ前のPBSの皿のため。
西部のしみの分析は蛋白質を、検査し従って私達によってはまた蛋白質がセルからのリリースであるためにそして蛋白質がプロテアーゼで切れられることを防いでほしい。 私達は西部のしみにこれらを必要とする:
-事を冷たい保つため! 西部にしみが付くことのためのセル換散の間の氷の4C
-セルの膜を蛋白質を解放するために分割するのに洗剤を使用しなさい
-バッファ
-リン蛋白質のための西部のしみをすれば抑制剤(プロテアーゼの両方抑制剤およびホスファターゼの抑制剤)
洗浄力がある-西部のしみのためのセルを分離させること
sdsおよびRIPAは西部にしみが付くことを使用してより遅い分析のための蛋白質を可溶性にするのに使用されている洗剤である。 これはセルか取付けられた中のセル膜の中に同様に多くの蛋白質ある必要となる、従って私達はそれらのためのimmunoblotにできるためにこれらの蛋白質を解放する必要がある。
[上]
西部のしみのために使用するために抗体を選ぶべきである。 通常マウスmonoclonal抗体かウサギのpolyclonalの抗体は使用される。
追加されたグループなしで抗体を使用できるまたはビオチンに活用される抗体を使用しなさい。 これらの抗体は必要とならない
Monoclonal抗体は通常西部にしみが付くことのためによりよいのために:
-よりよい信号対雑音の比率(西部のしみのより低い背景)
-より高い特定性(より少ない汚染蛋白質かIgを得る)
-全面的な洗剤は西部のしみが付くフィルム(検出されるより少なく無指定バンド)で起因する
Polyclonalの抗体はImmunoprecipitationによりよく適する:
-それらはより多くのepitopesを認識する
-より高い欲求心を持ちなさい
[上]
あなたの前の先端は西部にしみが付くことのために分離する:
蛋白質の大容量(ie phosphorylatedでない)のための西部のしみに蛋白質行けば:
-大量で分離できる(他の蛋白質のためにしみが付くために残りを保つ)
西部のしみにリン蛋白質行けば(またはphosphorylated蛋白質)次をすることは重要である:
-ホスファターゼが蛋白質から隣酸塩を取除くので使用のホスファターゼの抑制剤確かめなさい(vanadateのような! )
-あなたが分離させたセルのほとんどをロードできるのでまた可能な最も小さいボリュームのセルを分離させなさい(ieは100のULのローディングバッファ、これでされる分離する。 これはリン蛋白質のために西部にしみが付くこと。時かなり弱い重要であるシグナルはである)
蛋白質蛋白質の相互作用を見れば:
-蛋白質蛋白質の相互作用を分離するこうして蛋白質が変化するようにsdsを使用しなければ(特に沸騰の後で)
-西部のしみが付く蛋白質蛋白質の相互作用、ieのネイティブ相互作用のために…そのようなRIPAより少なく厳しい洗剤を使用しなければならない。
分離:
-版か皿で直接することができる
-セルを小球形にしなさい
-氷および風邪で保ちなさい-アイスペールを使用しなさい
-どの位換散バッファ使用することはであるかのための経験則: 換散バッファの10^5セル/UL
- eppendorfの管で集め、分類しなさい(氷のこれらを保ちなさい)
西部のしみの分析の前に全体蛋白質を測定しなさい:
-これは西部のしみの分析の処置の条件を比較したいと思えば数量化解析を可能にする
-商業キットは全体蛋白質を測定するためにブラッドフォードの試金のような使用できる(生物ラドから)
- sdsかより大きい缶の0.1%は蛋白質の測定と干渉する
蛋白質のサンプルを変化させなさい:
-セルlysateの因数に蛋白質のローディングのサンプルバッファを追加しなさい-染料を含んでいる(余りにゲル、2% sdsの移行を見なさい)
-ベータのような二硫化物の還元剤を- mercaptoethanol追加しなさい
-湯せんまたは暖房のブロック(中間のような低温-の沸騰90度は蛋白質の集合を減らす)。
-ぽんと鳴ることを防ぐように各管の帽子の穴を突きなさい
SDS-PAGEのゲルは電流の前で蛋白質を分けるのにサイズによって使用されているゲルのマトリックスである。 低いパーセントのゲルはより高いパーセントのゲルがより小さい蛋白質をよりよく分ける一方より大きい蛋白質を分ける。 問題はすべての蛋白質にそれらと準満たされるある電気流れでこれは問題を起こすことができることであり。 これは蛋白質のサンプルへのsdsの付加によって解決する。 sdsは蛋白質にあらゆる少数のアミノ酸を結合し、蛋白質にある充満相違を中和する。 これは蛋白質がサイズでとない充満で分かれているようにする。
[上]
-どの位によって蛋白質を西部にしみが付くことのためにロードしたいと思うか小さい櫛かより大きい櫛を使用するべきである。
- acrylamideのパーセントは重要である。 通常10%のacrylamideは使用される。
-解決のゲルは8.8のpHの底で使用される
ローディングの後で蛋白質を一緒に詰めるのに-スタッキングのゲル(4-5%) pH 6.8が使用されている
-ゲルの重合はポリアクリルアミドゲルの重合反作用を(形成および怯固)高速化する触媒apsおよびTEMEDによって高められる。
-あらゆるサンプルをゆっくり車線から漏るサンプルを防ぐために注意深くロードすれば。
-あらゆる車線をロードし、それぞれでサンプルバッファを使用しなさい(相違を防ぐため)。
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-ガラス間のそしてゲルの下の泡のための腕時計-働いていることをこれは意味する
-蛋白質の移行のための腕時計(ダウン状態になるべきである) -ない鉛を切替え、サンプルをすべて失うことができれば!
-最初にスタッキングのゲル(~ 50ボルト)を通って、これ与えるより鋭いバンドをゆっくりランしなさい。
-夜通しランしてはいけない
-ゲルを過熱させ(これによりゲルは剛性率を失うresoloving貧乏人およびぼやけた悪く形作られたバンドに導く)
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膜のタイプを選びなさい:
次のいずれかを使用できる:
-西部のしみのためのPVDFの膜
-西部のしみのための硝酸セルロースの膜
-ナイロン膜(稀に-引き裂くことができない今使用される)
西部の膜への転送のためのヒント:
-手袋をいつも身に着けなさい! 鉗子を使用しなさい
-膜に触れるか、または鉗子を最小にしなさい
生物ラド転送順序:
(-)
黒のスポンジ
フィルターペーパー
ゲルの硝酸セルロース
フィルターペーパー
スポンジ
(+)
転送:
- 4Cで涼しい保ちなさい
- 35ボルトで夜通し転送しなさい
-より高いvで1時間にすぐに転送できる
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膜の妨害はシグナルを最大にすることを可能にする: 騒音の比率
-手袋を身に着けなさい
- Blotto 5%のブロック(脱脂乾燥したミルク-粉)またはphosphorylated蛋白質のための1 - 5% BSA (牛のような血清アルブミン)。
-バッファはTBSTである
妨害の後の洗浄
-ステップを妨げた後洗浄は一次抗体の孵化の間に重大、ので人々の頻繁にブロックでない。
-洗浄は通常TBSTバッファと終った。 TBSTの大きいボリュームとすぐにすることができる。
一次抗体との孵化
-マウス、ウサギまたは他の種
-通常1: TBSTの1000年の希薄
-高いバックグラウンドか多くの無指定バンドが問題なら、孵化は5% BSAかミルクとすることができる。
一次抗体の後の洗浄
-そう重大
-大量のTBSTとすぐに洗浄できる
二次抗体の孵化
-通常薄くされた1: 10、TBSTとの000
-反マウス、反ウサギ、または他の抗体は検出のためのHRPの酵素と活用した
二次抗体の後の洗浄
-重大
- TBSTの5分の洗浄5 x。
-実際に急がなければならなければ大量のTBSTとの少なくとも3回を洗浄するため。
結果のための試金
-通常ecl (高められた化学ルミネセンス)は使用される
-フィルムは露出され、開発される。 10秒の露出は全体蛋白質のため十分に通常である。 リン蛋白質は2つ- 20の微細な露出を必要とすることができる。
-フィルムは通常XOMATまたは同じような「速い」フィルムである
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WB -西部のしみ
IB - immunoblot (西部にしみが付くことのための別のターム)
sds -ナトリウムDodecyl硫酸塩(多くの西部のしみが付く解決で使用される洗剤)
ページ- Polyacrilamideのゲルの電気泳動
ab -抗体(興味の蛋白質を検出するのに抗体が使用されている)
HRP -馬ラディッシュの過酸化酵素
Luminol - HRPが軽い形成に引き起こすために裂く基板
ecl -高められた化学ルミネセンス(軽い形成をHRP + Luminol高める西部のしみの解決)
kD/kDa - kilodalton (ほとんどの蛋白質は30平均する- 80 kDaの間で)
RAM -ウサギ反マウスIg
Ig -免疫グロブリン(抗体のisotype)
NP-40 - Nonidet P-40
PMSF - phenylmethylsulfonylのフッ化物
BSA -牛のような血清アルブミン
NFDM -脱脂乾燥したミルク
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西部のしみのトピック
西部のしみは対Immunohistochemistry誰か私にこの2間の相違をわかることができるか。 私は訂正する通常人々が西部のしみを行ない、によって…続かれると言うためにある
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restripping膜のための最適のプロトコルちょっと私はreprobeに私が第2の品質によってかなり矛盾している以前それを…した時多くの膜を持ち、
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粗野な血しょう膜こんにちは! 私は西部にしみが付くことのためのラットの頭脳からの血しょう膜の一部分を必要とする。 私はただmembrain蛋白質のcocncentrationを増加したいと思う…
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