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また見なさい: 外部サイトへの関連リンク: 西部のしみ

西部のしみ

音声部分: 詳しい西部のしみの説明を聞きなさい! 礼儀: 各国用の人間のゲノムの研究所。

西部のしみ定義: 西部にしみが付くことは特定の抗体に結合する機能に基づく蛋白質を識別し、見つけるのに使用される技術である。

   西部のしみの分析は多数の蛋白質の混合物からの興味の蛋白質を検出できる。  西部にしみが付くことは(kDa のサイズのマーカーへの比較とか梯子) 蛋白質のサイズの情報を与えることができ、また蛋白質の表現の情報を与える(未処理のサンプルのような制御への比較とか別のセルタイプまたはティッシュ) 。 

概要: 西部のしみはの情報を与える:

蛋白質のサイズ

蛋白質の表現量

西部のしみの分析はセルかティッシュから、また試験管内で総合される組換え蛋白質を分析するできるどうか蛋白質のサンプルを分析できる。 西部のしみは細目がこの蛋白質のためそれどのようにであるかあなたが興味の蛋白質のために厳密に調べるのに使用する抗体の品質に依存して。 抗体は商業ソースから獲得可能容易に今であり、興味の蛋白質のための1 つを購入できる。蛋白質が新しい蛋白質なら、抗体をあなた自身作り出すか、または会社をあなたのためのそれをするために得なければならない。この場合少なくとも少しをセルエキスから浄化されるか、または組換えとしてなされた蛋白質必要とする(インビトロまたは組換え蛋白質の 表現システムでie) 。   蛋白質に特定の抗体はたくさんの西部のしみの蛋白質の代りに興味の蛋白質にとりわけ結合できるので西部にしみが付くことに重大である!

図1 。西部のしみのための蛋白質の取得にかかわるステップの細部。

 図2 。西部のしみを行なうことのステップを詳しく述べる図。

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西部にしみが付くことはどのように働くか。

図表 1 を次に 見なさい。最初事第1 。あなたが分析したいと思うセルサンプルのような蛋白質のサンプルを得なさい。蛋白質内容を解放するためにセルを分離させなさい。サイズに基づいて蛋白質を分けるゲルのこれらをランしなさい。それから電気を使用して膜にこれらのゲル蛋白質を転送しなさい。この膜がそれから一次抗体を使用して興味の蛋白質のために厳密に調べるのに使用することができる。

西部のしみを必要とする何:

蛋白質のサンプル

興味の蛋白質を検出するよい抗体

膜と前にゲルのたくさんの蛋白質からのこの蛋白質を検出するために西部のしみは一次抗体に頼る! (セルは30,000 の蛋白質を含み、- これらの同じ蛋白質は変えることができ300,000 の蛋白質に! 与える) 。抗体を使用して一次抗体(二次抗体) をあなたが蛋白質抗体抗体サンドイッチを造り上げる確認する!  二次抗体に軽い解放の物質にluminol の基板を変える馬radish の過酸化酵素の酵素がある! このライトはフィルムの点として検出される。この点からどの位蛋白質が他の点に関連してそこにある、またはゲルでまたランされるサイズのマーカーかに関連する蛋白質のサイズ定めることができる。

図表2 は 西部のしみの例のゲルを示す。車線1 は蛋白質の異なった知られていたサイズを示す蛋白質の サイズの マーカーの梯子、これ商業的に購入することができるであり、すべての点のサイズはパンフレットで与えられる。車線3 は癌のサンプルであり、車線5 は正常なサンプルである。見ることができるように車線3 の蛋白質に興味深い車線5 で癌のサンプルより高い表現がある。また、車線3 及び5 の蛋白質の点は車線1 からのサイズの梯子の第2 点同じサイズである。私達はそれから私達が梯子と受け取った私達のパンフレットからの知られていた蛋白質のサイズを見ることができる。私達はそれから蛋白質のサイズが80 kDa であることを定める。興味の私達の蛋白質は80 kDa またである。そう私達は西部のしみが働いたこと、そして蛋白質が癌のサンプルに非常に表現されることを知っている!

蛋白質を検出するため:

一次抗体ソースに対して抗体を買いなさい

結果を得るのにECL を- 化学ルミネセンスのキット及びフィルム使用しなさい

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図表1 。                                                                                                                                      図表2 。

他にすべてが西部のしみについてそこにあることを今学びなさい!

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西部のしみのためにできている順序で目録、:

西部にしみが付くことのステップ:

- 西部のしみのために準備する

- 西部のしみのために使用するべき抗体

- 西部のしみのためのセルを分離させること

- SDS-PAGE のゲル情報

- 西部のしみのためのSDS-PAGE のゲルの準備

- ゲルの電気泳動- ゲルをランすること

- 西部にしみが付くことのための膜への蛋白質のTranfer

- 西部のしみ

西部のしみの分析で使用されるターム及び定義

最も最近の 西部のしみのトピック!

 

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西部のしみの分析のステップ:

- Prepartation を見本抽出しなさい

- バッファを分離させること

- 抗体

- セルを分離させること

- 準備をゼリー状になりなさい

- ランするゲル

- ゲルの転送

- 制御

- 西部のしみ

- 読み出し

- 分析及び解釈

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サンプルを西部のしみのために準備するため:

非付着性のセル(T セルラインか周辺血球のような) または付着性のセルを(繊維芽細胞のセルかCOS のセルのような) 有するどうか、媒体から無関係蛋白質を取除く必要がある。非付着性のセルのために穏やかに遠心分離とのそれらを小球形にし、次にPBS の餌を洗浄できる。付着性のセル、簡単な洗浄フラスコまたは西部のしみ前のPBS の皿のため。

 

西部のしみの分析は蛋白質を、検査し従って私達によってはまた蛋白質がセルからのリリースであるためにそして蛋白質がプロテアーゼによって切れられることを防いでほしい。私達は西部のしみにこれらを必要とする:

- 事を冷たい保つため! 西部にしみが付くことのためのセル換散の間の氷の4C

- セルの膜を蛋白質を解放するために分割するのに洗剤を使用しなさい

- バッファ

- 私達がリン蛋白質のための西部のしみをすれば) 抑制剤(プロテアーゼの両方抑制剤及びホスファターゼの抑制剤

 

洗浄力がある- 西部のしみのためのセルを分離させること

SDS 及びRIPA は西部にしみが付くことを使用してより遅い分析のための蛋白質を可溶性にするのに使用されている洗剤である。これはセルか取付けられた中のセル膜の中に同様に多くの蛋白質ある必要となる、従って私達はそれらのためのimmunoblot にできるためにこれらの蛋白質を解放する必要がある。

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私はどの抗体を西部にしみが付くことのために使用するべきであるか。

西部のしみのために使用するために抗体を選ぶべきである。 通常マウスmonoclonal 抗体かウサギのpolyclonal の抗体は使用される。

追加されたグループのない抗体を使用できるまたはビオチンに活用される抗体を使用しなさい。これらの抗体は必要とならない

 

西部のしみのためのMonoclonal 抗体対Polyclonal

Monoclonal 抗体は 西部にしみが付くことのために通常よりよいのために:

- (西部のしみのより低い背景) よりよいノイズ比率へのシグナル

- より高い特定性(より少ない汚染蛋白質かIg を得る)

- 全面的な洗剤は西部のしみが付くフィルム(検出されるより少なく無指定バンド) で起因する

 

Polyclonal の抗体は Immunoprecipitation のためによりよく適する:

- それらはより多くのepitopes を確認する

- より高い欲求心を持ちなさい

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西部のしみのためのセルの分離:

あなたの前の先端は西部にしみが付くことのために分離する:

蛋白質の大容量(ie phosphorylated でない) のための西部のしみに蛋白質行けば:

- 他の蛋白質のためにしみが付くために残りを保つ大量でできる() 分離

 

西部のしみにリン蛋白質行けば (またはphosphorylated 蛋白質) 次をすることは重要である:

- ホスファターゼが蛋白質から隣酸塩を取除くので使用のホスファターゼの抑制剤確かめる(vanadate のような! )

- あなたが分離させたセルのほとんどをロードできるのでまた可能な最も小さいボリュームのセルを分離させなさい(ie は100 つのUL のローディングバッファ、これでされる分離する。これはリン蛋白質のために西部にしみが付くことが。時かなり弱い重要であるシグナルはである)

 

蛋白質蛋白質の相互作用を見れば:

- 蛋白質蛋白質の相互作用を分離するこうして蛋白質が変化するようにSDS を使用しなければ(特に沸騰の後で)

- 西部のしみが付く蛋白質蛋白質の相互作用、ie のネイティブ相互作用のために…そのようなRIPA より少なく厳しい洗剤を使用しなければならない。

 

分離:

- 版か皿で直接されるできる

- セルを小球形にしなさい

- 氷及び風邪で保ちなさい- アイスペールを使用しなさい

- どの位換散バッファ使用することはであるかのための目分量: 換散バッファの10^5 セル/UL

- eppendorf の管及びラベルで集めなさい(氷のこれらを保ちなさい)

 

西部のしみの分析の前に全体蛋白質を測定しなさい:

- これは西部のしみの分析の処置の条件を比較したいと思えば数量化解析を可能にする

- 商業キットは全体蛋白質を測定する為にブラッドフォードの試金のような使用できる(Bio ラドから)

- SDS かより大きい缶の0.1% は蛋白質の測定と干渉する

 

蛋白質のサンプルを変化させなさい:

- セルlysate の因数に蛋白質のローディングのサンプルバッファを追加しなさい- 染料を含んでいる(余りにゲル、2% SDS の移行を見なさい)

- ベータのような二硫化物の還元剤を- mercaptoethanol 追加しなさい

- 水浴室または暖房のブロック(中間のような低温- の沸騰90 度は蛋白質の集合を減らす) 。

- ぽんと鳴ることを防ぐように各管の帽子の穴を突きなさい

 

西部にしみが付くことのためのSDS-PAGE のゲル情報

SDS-PAGE のゲルは電気流れの前で蛋白質を分けるのにサイズによって使用されているゲルのマトリックスである。低いパーセントのゲルはより高いパーセントのゲルがより小さい蛋白質をよりよく分ける一方より大きい蛋白質を分ける。問題は蛋白質すべてにそれらと準満たされるある電気流れでこれは問題を起こすことができることであり。これは蛋白質のサンプルへのSDS の付加によって解決する。SDS は蛋白質にあらゆる少数のアミノ酸を結合し、蛋白質にある充満相違を中和する。これは蛋白質がサイズとない充満によって分かれているようにする。

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西部のしみのためのSDS-PAGE のゲルの準備

- どの位によって蛋白質を西部にしみが付くことのためにロードしたいと思うか小さい櫛かより大きい櫛を使用するべきである。

- acrylamide のパーセントは重要である。通常10% のacrylamide は使用される。

- 解決のゲルは8.8 のpH の底で使用される

- ローディングの後で蛋白質を一緒に詰めるのにスタッキングのゲル(4-5%) pH 6.8 が使用されている

- ゲルの重合は�&リアクリルアミドゲルの重合反作用の(形成及び怯固) スピードをあげる触媒APS 及びTEMED によって高められる。

- あらゆるサンプルをゆっくり車線から漏るサンプルを防ぐために注意深くロードすれば。

- あらゆる車線をロードし、それぞれでサンプルバッファを使用しなさい(相違を防ぐため) 。

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電気泳動をゼリー状になりなさい

1. 沸騰の後の10 秒のためのサンプルを遠心分離機にかけなさい。
2. 各車線にサンプルをロードしなさい
3. MW の参照をロードしなさい
4. ゲルを100V (一定した電圧) でランしなさいまたは40 mA (一定した流れ) でよくしなさい。蛋白質marker/ladder を見るか、またはゲルを停止するためにいつのための前部を染めなさい。一定した流れは時間があればよりよく、より鋭い結果を与える。

- ガラス間のそしてゲルの下の泡のための腕時計- 働いていることをこれは意味する

- 蛋白質の移行のための腕時計(行くべきである) - ない鉛を切替え、サンプルすべてを失うことができれば!

- 最初にスタッキングのゲル(これ、~ 50 ボルト) を通って与えるより鋭いバンドをゆっくりランしなさい。

- 夜通しランしてはいけない

- ゲルを過熱させ(これによりゲルは剛性率を失うresoloving 貧乏人及びblurry 悪く形作られたバンドに導く)

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西部にしみが付くことのための膜への蛋白質のTranfer

膜のタイプを選びなさい:

どちらかを使用するできる:

- 西部のしみのためのPVDF の膜

- 西部のしみのための硝酸セルロースの膜

- 今使用されるナイロン膜(稀に- 引き裂くできない)

 

西部の膜へのTransfering のためのヒント:

- 手袋をいつも身に着けなさい! 鉗子を使用しなさい

- 膜にtouching/forceps を最小にしなさい

 

Bio ラド転送順序:

(-)
黒のス�&ンジ
フィルターペーパー
ゲルの硝酸セルロース
フィルターペーパー
ス�&ンジ
(+)

転送 :

- 4C で涼しい保ちなさい

- 35 ボルトで夜通し転送しなさい

- より高いV で1 時間にすぐに転送するできる

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西部のしみ

膜の妨害は signal:noise の比率を最大にすることを可能にする

- 手袋を身に着けなさい

- Blotto 5% のブロック(脱脂乾燥したミルク- 粉) またはアルブミンphosphorylated 蛋白質のための1 - 5% BSA (牛のような血清) 。

- バッファはTBST である

妨害の後の洗浄

- ステップを妨げた後洗浄は重大、ので一次抗体の孵化の間の人々の頻繁にブロックでない。

- 洗浄は通常TBST バッファと終った。TBST の大きいボリュームとすぐにされるできる。

一次抗体との孵化

- マウス、ウサギまたは他の種

- 通常1: TBST の1000 年の希薄

- 高いbackground/many 無指定バンドが問題なら、孵化は5% BSA かミルクとすることができる。

一次抗体の後の洗浄

- そう重大

- 大量のTBST とすぐに洗浄するできる

二次抗体の孵化

- 通常薄くされた1: TBST の10, 000

- 反マウス、反ウサギ、または他の抗体は検出のためのHRP の酵素と活用した

二次抗体の後の洗浄

- 重大

- TBST の5 分の洗浄5 X 。

- 実際に急がなければならなければ大量のTBST との少なくとも3 回を洗浄するため。

結果のための試金

- 通常ECL (高められた化学ルミネセンス) は使用される

- フィルムは露出され、開発される。10 秒の露出は全体蛋白質のため十分に通常である。リン蛋白質は2 つ- 20 の微細な露出を必要とすることができる。

- フィルムはXOMAT または同じような' 速い' フィルム通常である

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トラブルシューテ-ィングの 西部のしみを見なさい

西部にしみが付くことで使用されるターム:

WB - 西部のしみ

IB - 別のタームimmunoblot (西部にしみが付くことのための)

SDS - ナトリウムDodecyl 硫酸塩(多くの西部のしみが付く解決で使用される洗剤)

ページ- Polyacrilamide のゲルの電気泳動

Ab - 抗体(興味の蛋白質を検出するのに抗体が使用されている)

HRP - 馬Radish の過酸化酵素

Luminol - HRP が軽い形成に引き起こすために裂く基板

ECL - 高められた化学ルミネセンス(軽い形成をHRP + Luminol 高める) 西部のしみの解決

kD/kDa - kilodalton (ほとんどの蛋白質は30 平均する- 80 kDa の間で)

RAM - ウサギ反マウスIg

Ig - Immunoglobulin(an の抗体のisotype)

NP-40 - Nonidet P-40

PMSF - phenylmethylsulfonyl のフッ化物

BSA - 牛のような血清アルブミン

NFDM - 脱脂乾燥したミルク

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