Bioinformatics のプロトコル、DNA のRNA 蛋白質Proteomics
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西部のしみが付く問題および解決への分子端末ガイド: それらのための共通の西部のしみの問題そして解決!
このガイド に追加できたら考えとの私達に連絡しなさい。
膜は暗い部屋で光っている
修理の西部のしみ問題:
- 膜への転送の間の空気泡のための貧乏人の転送
- 開発者に追加する場合の汚れたフィルム
- 開発者ロールは汚れている
フィルムの点への解決:
- pasteur のピペットをローラーロールとして膜使用し、転送の前にぬれた泡たくわえ膜及び材料を取除くためにゼリー状になりなさい。
- フィルムを開発者へ追加する前にきれい保ちなさい
修理の西部のしみ問題:
- 通常多くの無指定バンドのために
- 悪い一次抗体の品質か古い抗体
- 十分に妨げない
- 抗原の蛋白質分解開裂- 追加バンドすべては蛋白質より低いMW である、(ie は蛋白質検出されるが、低下した)
西部のしみの余りにも多くのバンドへの解決:
- 別の抗体を購入するか、または新しい抗体の在庫と取り替えなさい
- 5% の乾燥した脱脂ミルクが付いているブロックか一次追加する前のBSA 。既に妨げたら、一次及び二次抗体の孵化の間にまた妨げ、増加することを考慮しミルクかBSA の集中を妨げる。
- 氷のすべてを保ち、新しいサンプルを使用し、- 80C を保存し、そしてPMSF のようなプロテアーゼの抑制剤を使用しなさい
修理の西部のしみ問題:
- またはあらゆる暗いフィルム黒くしなさい; フィルムは余りに長く露出された
- 妨害は不十分だった; 一次抗体の無指定の結合および二次抗体は完全に洗浄されなかった
- 洗浄は不十分だった
- フィルムは暗闇で光る! - 余りに高い二次か一次希薄
暗いフィルムへの解決:
- より少ない時間の暴露、減少露光時間
- 脱脂乾燥したミルク5% の孵化の持続期間を妨げることを高めるか、または集中を高めなさい。
- また(または前に) 二次抗体を持つホスト動物の全血清と妨げることを試みることができる
- 洗浄の時を増加すればヘルプへのボリュームは弱い抗体の結合のために無指定のシグナルを除去する。
洗浄することは、(より厳しい洗浄を提供し、背景を減らすかもしれないSDS またはNP-40 のようなより強い洗剤を使用する- TBST (Tween-20 20) の代りに…- より強い洗剤を使用して…バンドが付くときだけこれを強いする! - また洗浄は興味のバンドを! 除去する)
- 非常に高い二次抗体(か一次) 集中- 適切な抗体の希薄を定めるために最適化の実験を更に薄くする抗体を行いなさい。
修理の西部のしみ問題:
- ない十分な蛋白質のために…ゲルでロードした
- 一次抗体は古くまたはよくない
- リン蛋白質は通常夜通しの一次抗体の孵化を必要とする
- ない十分な二次抗体
- に妨げる
- 成長の試薬はそれらを準備するとき悪い/あなた作った間違いをである
低いシグナルまたは弱いシグナルへの解決:
- ゲルにより多くの蛋白質のサンプルをロードしなさい
- 新しい一次抗体を試みなさい
- 4 度のでリン蛋白質のための一次抗体のovernite をC (冷蔵室のシェーカー) incubate
- 蛋白質の集中を高めなさい(より少ない換散バッファのサンプルを分離させなさい)
- 妨害エージェントの集中を減らしなさい
- 成長の試薬を点検しなさい; 新しいECL を再ECL 膜準備すれば
- 一次抗体の孵化ピリオドの集中か長さを増加しなさい
- 二次抗体の孵化ピリオドの集中か長さを増加しなさい
- 熱いゲルのために塗りつけられるバンド
- 高圧のために曖昧なバンド
曖昧なバンドおよびUn-sharp バンドへの解決:
- 電圧をまたは現在減らし、冷蔵室でランし、そして新しい連続したバッファを準備しなさい(熱によりゲルは剛性率および解像力を失う)
- (膜の製造業者によって定められる) 必須の時間のための適切な転送の解決で転送の膜を前浸しなさい。
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