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Immunoprecipitation

Immunoprecipitation は解決からそれらの蛋白質を取除くのに蛋白質に特定の抗体を使用する技術である。抗体蛋白質の複合体は抗体の結合蛋白質の不溶解性形式の付加が付いている解決から沈殿する。例は解決に蛋白質A 、蛋白質G 、第2 抗体のZysorbin 、Immunoprecipitin 、または付加が含まれている(図表1 を次に見なさい) 。

Immunoprecipitation の目録

1. Immunoprecipitation の背景
2. Immunoprecipitation バッファ
3. 最近のImmunoprecipitation のトピック
4. Immunoprecipitation はプロトコルを作成する
5. Immunoprecipitation の時事通信
6. Immunoprecipitation の記事
7. Immunoprecipitation のトラブルシューテ-ィング

図表1 。

サンプルは沈殿物及び遠心分離の後でそれから洗浄することができる。沈殿物は蛋白質のサンプルバッファが付いているSDS-PAGE のゲルでそれからランすることができる。通常蛋白質のサンプルはセル換散前にradiolabeled である。これは通常セルへradiolabeled アミノ酸を追加することによってされる。これは点としてゲルでランされたとき蛋白質がフィルムでそれから容易に出し、放射能を露出するフィルムを検出されると同時に事を簡単にさせる。蛋白質のサイズ(標準を大きさで分類する比較を用いる分子量で) 、および量のためにそれから査定できる(と扱われたサンプルをまたは量の標準比較することによって) 。

さらに、immunoprecipitation プロシージャはまた非常に豊富または西部のしみを使用して検出しにくくない蛋白質の集中を可能にする。IP は大量のセルlysates を取り、西部のしみの分析か他の方法に使用することができる小さい沈殿物に興味の蛋白質を集中できると同時に10,000 折る蛋白質をまで集中できる。

 

Immunoprecipitation のアプリケーション:

1) 分子量そして量の決定はのSDS-PAGE によって蛋白質をimmunoprecipitated 。

2) 蛋白質蛋白質の相互作用のために査定するのにImmunoprecipitation が使用されている。これは1 つの蛋白質のためのimmunoprecipitation 、及び別の蛋白質のためにしみが付くことによってされる。

3) 特定の時間の間になされる量radiolabeled 蛋白質の決定によるセルの蛋白質の統合の率の定量化。

4) Immunoprecipitation は検出し別の方法でにくい蛋白質の集中に可能になる。

 

immunoprecipitation 方法は複数のステップに分けることができる:

1. サンプル準備及びセル換散
2. 解決のPreclearing
3. 抗体抗原の複合体の抗体そして形成の孵化
4. 興味の複合体の沈殿物
5. 無指定蛋白質および汚染物を除去する抗体抗原の複合体の洗浄。
6. SDS-PAGE 著興味のcomplexes/antigen の分析

Immunoprecipitation はプロトコルを作成する	Immunoprecipitation のプロトコルディレクトリ(外部リンク)	Immunoprecipitation を修理しなさい	Immunoprecipitation について学びなさい

Immunoprecipitation のサンプル準備及びセル換散

 

Immunoprecipitation の換散バッファ

immunoprecipitation またはIP のアプリケーションによって、異なった換散バッファを使用したいと思う。  換散バッファの選択は重要、興味の蛋白質の特性に依存している。

蛋白質または蛋白質蛋白質の相互作用のリン酸化を調査したいと思いなさいNp-40 を試みるべきである。

蛋白質の全体蛋白質のレベルを調査すれば、RIPA を試みるべきである。

RIPA バッファは immunoprecipitation のより低い背景を与える。但し、RIPA はある蛋白質を変化できる。行なえば蛋白質蛋白質の相互作用protein:protein の相互作用を破壊できると同時に、RIPA を調査するためにimmunoprecipitation は使用されるべきでない実験する。

NP-40 バッファに より低いdeanturing レベルがあり、キナーゼ作業を見ることのようなリン酸化の実験のためにこうして使用される。またNP-40 は蛋白質蛋白質の相互作用のために使用される。NP40 は非イオン洗剤、immunoprecipitation 及び西部のしみのためのセル換散バッファの最も一般的な洗剤である。

RIPA のセル換散バッファ- Immunoprecipitation バッファ調理法

• 50 ミリメートルTris-HCl
• pH 7.4 に調節しなさい
• NaCl 150 ミリメートルの
• 1 ミリメートルPMSF
• 1 ミリメートルのEDTA
• 5 .g/ml Aprotinin
• 5 .g/ml Leupeptin
• 1% トリトンx-100
• 1% ナトリウムのdeoxycholate
• 0.1% SDS

NP-40 セル換散バッファ- Immunoprecipitation バッファ調理法

• 集中50 ミリメートルのTris-HCl の最終の
• 集中150 ミリメートルのNaCl の最終の
• 1% NP-40 を追加しなさい
• pH 8.0 に調節しなさい

Immunoprecipitation のための前清算

preclear ステップは通常immunoprecipitation のためにセルlysate の無指定蛋白質の量を下げるので終った。なお、前清算はまた蛋白質A の蛋白質G 、Immunoprecipitin 、Zysorbin のための可能な無指定の相互作用そして高い親和性があるかもしれない または抗体の結合蛋白質 のどんな不溶解性形式プルダウンに抗体を使用している蛋白質を取除く。何人かの研究者はこのステップを不必要見つけ、このステップをとばす。immunoprecipitation を試みる時最初に試みの前清算。結果がかなり明確、前清算の次の実験をとばすことを試み、どのようになるか見なさい。

 

IP: 抗体抗原の複合体の孵化の抗体そして形成

どの抗体をimmunoprecipitation のために使用するべきであるか。通常Polyclonal の抗体はimmunoprecipation のために使用される。

 

Immunoprecipitation - 興味の複合体の沈殿物

抗体抗原の複合体は彼ら自身のie. のimmunoprecipitation によって不溶解性、でない完全な考えでない。抗原への抗体そして結合は血、バッファで、そしてimmunoprecipitation の実験の間に溶ける。  これらの複合体から沈殿するのに使用されている何が不溶解性の抗体の結合蛋白質である。蛋白質A 及びG は細菌から、隔離され、抗体の一定した領域に結合する。

immunoprecipitation の複合体を沈殿させるのに使用される不溶解性の抗体の結合蛋白質の例は次のとおりである:

• 蛋白質A
• 蛋白質G
• Zysorbin
• Immunoprecipitin

Immunoprecipitation - 洗浄して歩む

  複合体を洗浄することはRIPA 、PBS を使用してIP の後で分析することを望むものをによってされたり、他のバッファをIP 洗浄する。RIPA バッファはPBS がより少なく厳しい一方より厳しい。

IP はバッファ調理法を洗浄する

• 10mM Tris; pH 7.4 に調節しなさい
• 1mM のEDTA
• 1mM EGTA; pH 8.0
• 150mM のNaCl
• 1% トリトンX-100
• 0.2mM ナトリウムのオルトortho-vanadate
• プロテアーゼの抑制剤のカクテル

 

Immunoprecipitation のための最終的なノート

  Immunoprecipitation の成功は抗原のための抗体の親和性に依存している。  よいimmunoprecipitation の抗体はIP の後の他の技術を使用してサンプルを分析する場合低い背景を与える。  使用される不溶解性の抗体結合蛋白質はまた非常に重要である。しかしPolyclonal の抗体はまた浄化されたmonoclonal 抗体を使用する最もよい抗体使用することができるである。  monoclonal 抗体がimmunoprecipitation のためにテストされたかどうか抗体のベンダーを確認しなさい。

 

Immunoprecipitation のためのヒント

• 彼らが沈殿すると同時に使用はimmunoprecipitation のための2 ML の管より容易に洗浄され、resuspended
• 時間を節約するために前清算のステップをとばす試み
• と洗浄するかわりにバッファ試みPBS をIP 洗浄しなさい
• 既に低い背景を有し、抗体が大きかったら、5X の代りに2X を洗浄するip を試みなさい
• 同様に多くの液体をeppendorf の管から取除くために時immunoprecipitation の洗浄確かめる

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