Immunoprecipitation

サンプルは沈殿物および遠心分離の後でそれから洗浄することができる。 沈殿物は蛋白質のサンプルバッファが付いているSDS-PAGEのゲルでそれから実行することができる。 通常蛋白質のサンプルはセル換散前にradiolabeledである。 これは通常セルへradiolabeledアミノ酸を追加することによってされる。 これは点としてゲルで実行されたとき蛋白質がフィルムでそれから容易に出す放射能および暴露フィルムを検出されると同時に事を簡単にさせる。 蛋白質のサイズ(標準を大きさで分類する比較を用いる分子量で)、および量のためにそれから査定できる(と扱われたサンプルをまたは量の標準比較することによって)。

さらに、immunoprecipitationプロシージャはまた非常に豊富または西部のしみを使用して検出しにくくない蛋白質の集中を可能にする。 IPは大量のセルlysatesを取り、西部のしみの分析か他の方法に使用することができる小さい沈殿物に興味の蛋白質を集中できると同時に10,000折る蛋白質をまで集中できる。

Immunoprecipitationのアプリケーション:

1) SDS-PAGEによるimmunoprecipitated蛋白質の分子量そして量の決定。

2)蛋白質蛋白質の相互作用のために査定するのにImmunoprecipitationが使用されている。 これは1つの蛋白質のためのimmunoprecipitation、および別の蛋白質のためにしみが付くことによってされる。

3)一定の間になされる量radiolabeled蛋白質の時間決定によるセルの蛋白質の統合の率の定量化。

4) Immunoprecipitationは検出し別の方法でにくい蛋白質の集中に可能になる。

immunoprecipitation方法は複数のステップに分けることができる:

immunoprecipitationまたはIPのアプリケーションによって、異なった換散バッファを使用したいと思う。  換散バッファの選択は重要、興味の蛋白質の特性に依存している。

蛋白質または蛋白質蛋白質の相互作用のリン酸化を調査したいと思いなさいNp40を裁判にかけるべきである。

蛋白質の全体蛋白質のレベルを調査すれば、RIPAを試みるべきである。

• 50のmM TrisHCl
• pH 7.4に調節しなさい
• NaCl 150のmMの
• 1つのmM PMSF
• 1つのmMのEDTA
• 5 µg/ml Aprotinin
• 5 µg/ml Leupeptin
• 1%トリトンx-100
• 1%ナトリウムのdeoxycholate
• 0.1% SDS

• 集中50のmMのTrisHClの最終の
• 集中150のmMのNaClの最終の
• 1% NP-40を追加しなさい
• pH 8.0に調節しなさい

preclearステップは通常immunoprecipitationのためにセルlysateの無指定蛋白質の量を下げるので行われる。 なお、前清算はまた蛋白質Aの蛋白質G、Immunoprecipitin、Zysorbinのための可能な無指定の相互作用そして高い親和性があるかもしれないまたは抗体の結合蛋白質のどんな不溶解性形式プルダウンに抗体を使用している蛋白質を取除く。 何人かの研究者はこのステップを不必要見つけ、このステップをとばす。 immunoprecipitationを試みる時最初に試みの前清算。 結果がかなり明確、前清算の次の実験をとばすことを試み、どのようになるか見なさい。

どの抗体をimmunoprecipitationのために使用するべきであるか。 通常Polyclonal抗体はimmunoprecipationのために使用される。

抗体抗原の複合体は独自で不溶解性、ieではない。 immunoprecipitationは、完全な考えではない。 抗原への抗体そして結合は血、バッファで、そしてimmunoprecipitationの実験の間に溶ける。  使用されているこれらの複合体を沈殿させるのに何が不溶解性の抗体の結合蛋白質である。 蛋白質AおよびGは細菌および縛りから抗体の一定した領域への、隔離された。

immunoprecipitationの複合体を沈殿させるのに使用される不溶解性の抗体の結合蛋白質の例は次のとおりである:

• 蛋白質A
• 蛋白質G
• Zysorbin
• Immunoprecipitin

  複合体を洗浄することはRIPA、PBSを使用してIPの後で分析することを望むものをによってされたり、他のバッファをIP洗浄する。 RIPAバッファはPBSがより少なく厳しい一方より厳しい。

IPはバッファ調理法を洗浄する

• 10mM Tris; pH 7.4に調節しなさい
• 1mMのEDTA
• 1mM EGTA; pH 8.0
• 150mM NaCl
• 1%トリトンX-100
• 0.2mMナトリウムのオルトvanadate
• プロテアーゼ抑制剤のカクテル

Immunoprecipitationのための最終的な注記

  Immunoprecipitationの成功は抗原のための抗体の親和性に依存している。  よいimmunoprecipitationの抗体はIPの後で他の技術を使用してサンプルを分析する場合低い背景を与える。  使用される不溶解性の抗体結合蛋白質はまた非常に重要である。 しかしPolyclonal抗体はまた浄化されたmonoclonal抗体を使用する最もよい抗体使用することができるである。  monoclonal抗体がimmunoprecipitationのためにテストされたかどうか抗体のベンダーを確認しなさい。

Immunoprecipitationのためのヒント

• それらが沈殿物より容易に洗浄され、再停止されるように使用immunoprecipitationのための2つのmLの管
• 時間を節約するために前清算のステップをとばす試み
• と洗浄するかわりにバッファ試みPBSをIP洗浄しなさい
• 既に低い背景を有し、抗体が大きかったら、5Xの代りに2Xを洗浄するipを試みなさい
• eppendorfの管から同様に多くの液体を取除くために時immunoprecipitationの洗浄確かめなさい