Immunoprecipitation のプロトコル

Immunoprecipitation 及びプロトコル。

基本的なImmunoprecipitation のプロトコルIP:

1 。セルを扱いなさい

2 。セルをバッファを可溶性にすることの500 のUL の追加によって収穫し、ス�&イトを21 正確に測る均質になる針X5 の時間を擦り、そして通りなさい。

3 。トリクロロ酸の沈殿物を行ないなさい(正規化するのにこれがradiolabeled S-35 のセル例えば使用される)

4 。前清算: 全サンプルへX の2 つの UL を、マウスまたはウサギまたはヤギの 血清(X が一次抗体が上がった動物種であるかところで) 追加することによって前明確及び室温で30 分の回転子でincubate 。

5 。室温の30 分の回転と30 のUL のimmunoprecipitin とincubating によってX の血清を除去しなさい。

6 。13 で3 分、000 のrpm のためのサンプルを遠心分離機にかけなさい。

7 。遠心分離の後で、Y が興味の蛋白質のための動物で上がる抗体である一次抗体(X のanti-Y 特定の蛋白質、) の5 つのUL をsupernatants に追加し、C 4 度ので夜通しincubate 。

8 。サンプルにimmunoprecipitin の100 つのUL を追加しなさい。代わりにZysorbin (Invitrogen) を使用できる。(Zysorbin はプロトコルへのある小変更を必要とする)

9 。13 の遠心分離機、3 分の000 のrpm 。上澄みを除去しなさい。

10 。1 ML の各洗浄間の5-10 分の間動揺の冷たいIP の洗浄バッファの餌3 X を(使用前のwah バッファにプロテアーゼの抑制剤を追加しなさい) 洗浄しなさい。

11 。SDS-PAGE のゲルでランするのにこの餌を使用しなさい。このにSDS のサンプルバッファ(蛋白質のローディングバッファ) 及び沸騰の後のゲルのロードをできる直接追加。