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正常なPCR は調節する

正常なPCR のためのパラメータ

正常なPCR を達成する問題を持たれているか。  多くの要因はPCR の結果にのような影響を与えることができる: 金属イオン補足因子、基板および基板のアナログ、バッファおよび塩およびCosolvents 。  また熱循環の考察:  PCR の容器、温度及び時間の最適化、PCR の拡大のサイクル、Enzyme/Target およびホットスタート。 

金属イオン補足因子及びPCR

PCR のDNA の�&リメラーゼのための必要な補足因子はマグネシウムの塩化物である。  その集中はあらゆるprimer:template システムのために最適化されなければならない。反作用の多くのコン�&ーネントはプライマー、テンプレート、PCR プロダクトおよびdNTPs を含むマグネシウムイオンを、結合する。マグネシウムイオンのための主要な1:1 の結合エージェントは反作用のdNTPs の高い集中である。自由なマグネシウムイオンがPCR の酵素の補足因子として役立つことは必要であるので総マグネシウムイオン集中は総dNTP の集中を超過しなければならない。普通、最適化プロセスを開始するために、塩化物1.5 ミリメートルはマグネシウムの0.8 ミリメートルの総dNTPs の前でPCR に追加される。これはDNA の�&リメラーゼのための自由なマグネシウム約0.7 ミリメートルの残す。大将では、マグネシウムイオンは0.5 ミリメートルのステップ1.5 の4.0 ミリメートルからの–集中シリーズで変わるべきである。

PCR のための基板そして基板のアナログ

DNA の�&リメラーゼはdNTPs を非常に効率的に組み込む。  それらはまたPCR で補足のコン�&ーネントとして使用されるとき修正された基板を組み込むことができる。DNA の�&リメラーゼに使用する基板の例は次のとおりである: Digoxigenin-dUTP 、ビオチン11 dUTP 、dUTP 、c7deaza-dGTP 、およびfluorescently 分類されたdNTPs 。慣習的なPCR のため、等モルの比率、例えば、200 のM でバランスをとられるdNTPs の残物の μ集中各dNTP 。またそれにのこれらの標準勧告からの偏差あるamplications で有利があるかもしれない注意しなさい。例えば、特定のターゲットの任意突然変異誘発が望まれるとき、不均衡なdNTP の集中はDNA の�&リメラーゼによってmisincorporations の高度を促進する。

PCR のためのバッファそして塩

DNA によって�&リメラーゼは最適のPCR バッファ集中、塩の集中を使用し、pH はDNA の�&リメラーゼにそれに応じて選ばれるべきである。Taq のDNA の�&リメラーゼのためのPCR バッファは室温でKCl 50 ミリメートルおよび10 ミリメートルTris-HCl 、pH 8.3 から、成っている。このバッファは反作用の間に必要とされるイオン強さおよびバッファリング容量を提供する。塩の集中がprimer:template のデュプレックスのTm に影響を与える、それ故にアニーリングの温度でありことに注意することは重要。

Cosolvents

PCR の拡大の収穫、効力、および特定性を高めるのに異なったPCR Cosolvents が使用されている。これらのcosolvents はある拡大で有利、他の拡大で不利である場合もある。従ってどの添加物が各primer:template のデュプレックスおよびcosolvent のために有用であるか予測することは不可能である経験的に各組合せのためにテストされなければならない。

熱循環の考察

PCR の容器

PCR は酵素及び核酸の低い量と互換性があるよい熱転移特性があり、容器に行われなければならない。通常、�&リプロピレンはPCR の容器のために使用され、慣習的な、thick-walled microcentrifuge の管は多くの熱cycler システムのために選択される。PCR は最も頻繁にL 10 100 つ反作用のスケール–で μ行われ、熱循環の間の閉じる反作用の管のevaporation/condensation プロセスの防止を必要とする。ミネラルオイルのオーバーレイまたはワックスの層はこの目的を機能する。最近、0.2 ML thin-walled 容器はPCR プロセスのために最適化され、サンプルブロックの内で保持される管上の熱くするカバーを使用するoil-free 熱cyclers は設計されていた。

温度及びサイクル時間の最適化

反応混合物が各々の熱サイクルの変性、アニーリング、および拡張温度に達することは必要である。不十分な一時待機時間があらゆる温度で指定されれば、サンプルの温度はサンプルブロックのそれと平衡させない。熱cycler は他が予測されたサンプル温度に一時待機時間を基づかせている一方、把握間隔がブロックの温度に基づかせていた時間を設計する。ブロックの温度によって制御されるcycler で使用される慣習的なthick-walled 管が60-s 一時待機時間平衡のために十分なら。より長いPCR プロダクトの余分時間は(72.C) 拡張ステップで推薦されるかもしれない。予測されたサンプル温度によって制御されるcycler のthin-walled 0.2 ML 管を使用して15 だけはs 必要となる。多重実験室で使用のために開発のプロトコルに既存のプロトコルをまたは使用するためには、cycler のデザイン及び管の壁厚さに従って一時待機時間を選択することは非常に重要である。

PCR の拡大のサイクル番号

PCR の拡大のサイクルの番号はターゲットDNA の開始の集中に関して最適化されるべきである。同じ集中に3 つの105 分子を– 増幅するために50 のターゲット分子を増幅することを40 の45 のサイクル–および25 の30 のサイクル × からこと、推薦する。この非比例はプロダクト蓄積の指数率の減少がPCR の後期で行われるいわゆるプラトーの効果によって引き起こされる。これは反応体(dNTPs 、酵素) の劣化によって引き起こされるかもしれない; 反応体の枯渇(プライマー、dNTPs); 最終製品の阻止(ピロリン酸塩の形成); 無指定プロダクトによる反応体のための競争; または集中された(10 nM) プロダクトのreannealing によって結合するプライマーのための競争。サイクルの番号が余分なら不必要な無指定プロダクトが干渉するので望ましい特定のプロダクトを見るのに必要とされるサイクルの最小値をランすることは通常勧められる。

 酵素/ターゲット

L 100 つ反作用に使用するTaq のDNA の�&リメラーゼの標準μ因数では約1010 分子がある。各PCR のサンプルは含んでいるか、または含むかもしれないターゲットコピーの番号のために評価されるべきである。例えば、lambda のDNA の1 NG は1.8 枚の107 枚の × コピーを含んでいる。低入力限定番号PCR のために、酵素は限定しているようになり、拡張プロセスにより多くの時間をインクレメンタルに与えることは必要かもしれない。PCR の収穫を最大にするために熱cyclers は確実にこの自動セグメント拡張プロシージャを行うことができる。

ホットスタートは調節する

上記の最適化のすべてはまた、ホットスタート方法の初めから、設計されているPCR に適用する。頻繁に、ホットスタートは反作用の状態を変更しないで前に最適化されたPCR に首尾よく組み込むことができる。但し、それは通常ホットスタートを追加した後reoptimize 支払う。最適化は可能ように同様に多くのプロダクトを作り出し、背景の拡大間のバランス無指定overproducing 頻繁にである。ホットスタートが背景の拡大を非常に減らすので、上部の制限は酵素の集中、サイクル番号、および金属イオン補足因子の集中のような条件で上がる。ホットスタートなしで非常に調整された敏感なPCRs はホットスタートが追加されるとき失敗するかもしれない。これは混合するか、または酵素の活発化によって引き起こされる早いサイクルでわずかな遅延によりによって引き起こすことができる。PCR は通常特定のプロダクトの相当な増加と単に増加によって、頻繁に、復元することができパラメータか試薬を限定する。さらに、各々のホットスタート方法に特定の最適化がある。混合するか、または酵素の活発化はPCR ボリューム、バッファ構成およびpH のcosolvents 、循環の条件によって、及びそう影響されることができる。特定のプロダクト’s 文献、頻繁にプロダクト挿入はこれらの考察の情報のために、相談されるべきである。