ポリメラーゼの連鎖反応(PCR)の歴史そして開発

      生物科学のためのツールが生命の調査を革命化したように30年以上前に、組換えDNA技術の導入。  分子クローニングは生きている有機体の個々の遺伝子の調査を可能にした; ただしこの技術は比較的たくさんの純粋なDNAの取得に依存していた。  これは微生物の細胞分裂の間にプラスミッドまたは他のベクトルのDNAの複製によって(1)決まった。  研究者はそれを非常に困難および生物的サンプル(2)で現在の遺伝子の大容量からの量の特定のDNAを得ること困難見つけた。   組換えDNA技術は複数の人間の病気の最初の分子分析および出生前の診断を可能にした。  羊水穿刺のサンプリングによって得られた胎児DNAはクローンとして作られた遺伝子またはオリゴヌクレオチドのプローブへの制限の酵素の消化力、電気泳動、南転送および交配によって(3)分析できる。  ただし、南しみが付くことは無関係な個人の遺伝子の基礎的なマップだけ(4)可能にした。 

PCRのポリメラーゼの連鎖反応(5,6)のための略称は、たくさんの生産に簡単な酵素の反作用の複雑なDNAのテンプレートからの特定のDNAを与えた。  PCRはDNAの生体外の拡大の最近開発されたプロシージャである。  PCRはほとんどすべてがとしてDNAのフラグメントの処理を必要とすることを行われるかもしれない簡易性および実用性(7)の結果調査する方法を変形させた。 
80年代では、Kary Mullis (図1)およびCetus CorporationのCetus Corporationの研究者のチームはDNAの単一繊維に沿う一定時点でポリメラーゼの処置を開始し、停止する方法の想像した。  Mullisはまた分子再生の技術のこのコンポーネントの利用によって、ターゲットDNAが指数関数的に増幅ことをできることを認識した。  このDNAの拡大プロシージャは生体内のプロセス(5,6,8)よりもむしろ生体外に基づいていた。  PCRによるCell-free DNAの拡大は分析するクローニングの標準手続きおよび修正の核酸の多数を簡素化(1)できた。  DNAの特定の部分を隔離するための前の技術は遺伝子クローニング-退屈で、遅いプロシージャに頼った。  PCRは、一方で「示されるケリーMullis」ほしいと同時にあなたによってが興味がある選び、それのその位可能にするDNAの部分をあることを(2,8)。   ポリメラーゼに連鎖反応をすることに成功するCetusの他の科学者が行う結局信頼できる方法で望まれるようにとき、無制限の量の彼らの作業(8)に必要な精密な遺伝物質の分子生物学者および他を本質的に提供するための無限に強力な技術を有した。  最初のレポートin1985以来、5000以上の学術論文は1992年(1)出版された。  なお、多数の出版物は当然PCRの技術の開発そしてアプリケーションへのすべての重要な貢献を見直すことを不可能にする; ただし私達は基本的なPCRの方法の最も重要な開発をここに見直すように試みる。 

PCRはEmeryville、CA.のCetus Corporationで働いている間1983の先生によってKerry Mullis想像されると考えられた。  ただし、開拓作業はまた1971年にGobind Khoranaによってだれが2つのプライマーを使用してDNAの部分の複製の基本原則を記述したか行われた。  進歩はプライマー統合およびポリメラーゼの浄化問題によってそれから(9)限定された。   Mullisのヘッドでは共通の人間の病気の突然変異を診断するために総合的なオリゴヌクレオチドを使用して一義的な人間の遺伝子の限られたdideoxynucleotideの配列を行うために、発明は理論的なスキームから大きくなった。  非常に直接配列の作戦への明らかな障害は人間のゲノム(3.3 x 109基礎ペア)のの高い複雑さだった。  従って最初のプライマーの統合の進行を妨げるために、第2オリゴヌクレオチドかプライマーは追加された。   しかし後で、この第2プライマーは突然変異体の対立遺伝子の各繊維が終局のシグナルに貢献するのは他のDNAの繊維に結合するために含まれていたからである。  および各繊維にプライマーの同時交配を含むスキームが混合物を熱することによって修正されたらそれからアニーリングをおよび拡張ステップ繰り返す、一次シグナルは増加されたそれ以上である。  ステップを繰り返すことは最初の円形の製品が2枚のコピーをもたらすために第2サイクルで複写されることを可能にする。  サイクルを繰り返すことは4枚のコピー、とceteraで再度起因する。  数週はこの良い考えが(8)試みられた前に渡った。  2つのプライマーは人間のbglobinの遺伝子のクローンとして作られたセグメントの110の基礎ペア領域の各終わりに完全に補足であるために総合された拡大は行われ、製品はacrylamideのゲルの電気泳動によって識別された。  最終結果は分子生物学(5,6)の基本的な技術としてPCRの予想された110の基礎ペアDNAのフラグメントそして始めだった。
Mullisの元のPCRプロセス(5,6,8)では、酵素は生体外で使用された(有機体の外の制御環境で)。  double-stranded DNAは2つの単一繊維に96°C.へのそれを熱することによって分かれていた。  しかしこの温度でエシェリヒア属大腸菌DNAポリメラーゼは酵素が各サイクルの暖房の段階の後で補充されなければならなかったのは破壊されたからである。  Mullisの元のPCRプロセスはPCRプロセス全体のDNAポリメラーゼの大量の時間、巨額の金、および絶え間ない関心を必要としたので非常に非能率的だった。

      PCRの拡大のメカニズムの検査は簡易性また優雅(図2)を明らかにする。  オリゴヌクレオチドのプライマーは増幅され、次にDNAのテンプレートとモル超過分混合されるシーケンスの終わりに補足であるように最初におよび適切なバッファのdeoxyribonucleotidesで設計されている。  オリジナルの繊維およびプライマーアニーリング、オリゴヌクレオチドを促進するために冷却を変化させる続く暖房ターゲットフラグメントの別の繊維への各縛り。  プライマーはそれぞれがDNAポリメラーゼの処置によって伸びるとき、最近総合された繊維が反対のオリゴヌクレオチドの結合サイトを重複するように置かれる。  変性、アニーリングおよびポリメラーゼの拡張のプロセスが続くと同時にプライマーは最近総合された繊維の元のDNAのテンプレートそして補足のサイト両方に繰り返し結合し、DNA (図3)の新しいコピーを作り出すために伸びる。  最終結果はnがサイクル(1,7,13)の番号の、理論的な多量の2nで最終的に表される、PCRのプライマー間のシーケンスを含んでいるDNAのフラグメントの総数の急激な増加である。

DNAポリメラーゼは自然発生する酵素、DNAの形成そして修理に触媒作用を及ぼす生物的高分子である。 それは単一DNAの繊維に不良部分および補足の繊維を作成することによって働く。  すべての生きている問題の正確な複製はDNAを複写するために作用するこの作業によってセルが分かれるとき決まる、(10,11)。  最近科学者だけをこの作業を処理し、科学研究に適用することを学びなさい。  最も早いPCRの実験は37Cの温度で人間のgenomic DNA (5,6)からの特定のターゲットを増幅するためにエシェリヒア属大腸菌DNAポリメラーゼIのKlenowのフラグメントをutlilized。  多くの場合これらのPCRの反作用はゲルの電気泳動(1)によって判断されるように不完全に純粋なターゲット製品を作り出した。  Klenowのフラグメントとのこれらの最初のPCRの拡大は非常に特定ではなかった(5,6)。  一義的なDNAのフラグメントがgenomic DNAからの増幅された~200,000フォールドであることができるがPCRの製品の約1%だけが目標とされたシーケンス(13)だった。  特定の交配のプローブは増幅されたDNA (5,6)を分析するために必要となった。  
あるPCRの状態はより低いMgCl2の集中およびより高いアニーリングの温度のようなプライマー交配の金詰りを高めるために定められた。
PCRの特定性をもたらすとなお、酵素およびプライマーの集中、PCRのアニーリング時、拡張時間および番号はすべてを見つけられた循環させる。
また、サンプルの特定のシーケンスの集中はまたPCRの製品(1,7,13,14,15)の相対的な同質性に影響を及ぼすことができる。   適切なバッファのDeoxyribonucleotideの三リン酸塩そしてマグネシウムはまたPCRのための重要な原料である。  PCRsの効率そして特定性は自由なマグネシウム、deoxyribonucleotideの三リン酸塩およびプライマーの集中そして比率の変化によって影響されることができる。  これらの試薬は高い特定性および収穫(14)を達成するために最適化されなければならない。  それはまたポリメラーゼの連鎖反応(15)によってこと拡大の特定性そして効率に対する温度およびオリゴヌクレオチドのプライマー長さの効果検出された。
繊維の分離に必要な各サイクル(5,6)の変性のステップの後で高温のエシェリヒア属大腸菌DNAポリメラーゼIのKlenowのフラグメントの不活性化は酵素の付加を必要とした。  1988年前に、PCRの反作用プロシージャを行なうだれでも一連の水浴室か熱するブロックによって忍耐強く坐り、への3分(7) ½のための沸騰水で反作用の容器を浸すことによって分普通遂行された各変性のステップの後でエシェリヒア属大腸菌DNAポリメラーゼの新しい因数を追加するために強いられた。   この幾分退屈なステップはPCRの反作用の始めにthermostable DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ(12)の導入によって、一度除去された。  終わる110Cの間欠泉で育つDNAポリメラーゼの作業のthermostable特性はThermusのaquaticus (Taq)から隔離された(図ポリメラーゼの連鎖反応(1,7,12非常に貢献し)の収穫、特定性、オートメーションおよびユーティリティに4)は。   Taqの酵素は94Cに繰り返された暖房に抗でき、オリゴヌクレオチドのプライマーが結合するように混合物が冷却されるたびにそう拡張のための触媒は既にある(1,7)。  ただし、より高いアニーリングの温度は単一まで「PCRの開発」(8)、細菌のThermusの好熱性のaquaticus (Taq)からの耐熱性DNAポリメラーゼの浄化および商業分布のほとんどの重要な開発(12)確立されなかった。 
それにより減るnontargetシーケンス(無指定の拡大)または増加する特定性に高温(1,7,12,13)で、遂行されるべき耐熱性DNAポリメラーゼのまた許可されたプライマーアニーリングおよび拡張の隔離はアニーリングの組合わせを誤まった。   このように、なぜなら多くの拡大PCRの製品は電気泳動のゲル(12)の単一のethidiumによって臭化物汚されたバンドとして検出できる。  この高められた特定性はまたターゲットシーケンスのDNAの収穫を増加した。  さらに、より長いPCRの製品はプライマー拡張に使用した高温のテンプレートの繊維の二次構造の減少によるgenomic DNAから、おそらく増幅できる。  Klenowのフラグメントのポリメラーゼの拡大のための上部のサイズの限界は400bpについてだけあった。  Taqのポリメラーゼおよび他のthermostableポリメラーゼはフラグメントの10までkb総合した(1,7,12,13)を。  Taqのポリメラーゼのアベイラビリティはまたそれが異なった温度を反作用の管をより酵素の因数のthermocyclingおよび付加を行う装置を製造するために通る器具を組み立てる大いにより容易なタスクであるので反作用のオートメーションを非常に簡素化した。  現在使用できるthermocyclersの商業的に大きい変化がある。  この開発は科学界によってこの技術の急速なアプリケーションの重要な要因ずっと(7)行う。 

      PCRによって形作られるかもしれないdouble-stranded、鈍終了されたDNAのフラグメントの生産に加えてPCRの2つの他の機能はPCRのユーティリティに非常に貢献する計画する。  最初に、プライマーの結合の位置は増幅されたフラグメントの境界を定義し、従って制限のendonucleaseの認識部位の前の分子クローニング条件はPCRに必要とならない。  DNAシーケンスの限られた数だけ制限のサイトであるので、PCRはフラグメントのサイズおよび構成の選択の柔軟性を非常に高める。  2番目に、PCRのオリゴヌクレオチドがテンプレートDNAに丁度補足であることは必要ではない。  増幅されたDNAに突然変異のような制限のendonucleaseの認識部位か他の有用なシーケンスをもたらすのにこうして開発されるかもしれない起爆剤のサイト内のシーケンスをもたらすために「テール」は5にプライマーの端'追加されるかもしれない。  この現象は急速なDNAのクローニング(1,7,13)のための方法としてPCRの出現を可能にした。

分子クローニングは技術としてPCRの出現から寄与した。  直接クローニングはPCRによって増幅された110のbp DNAのフラグメントを使用して最初に行なわれ、含んでいたオリゴヌクレオチドのプライマーは5つの'端に制限のendonucleaseの認識部位追加した。  これらのサイトがM13プラスミッドに増幅されたDNAのクローニングを(17)促進するのに使用された。  110のbpのフラグメントはまたこのアプローチがクローニングへ急流けれども信頼できるアプローチだったことを確認するために配列された。  (図5)

細胞に基づくDNAのクローニングはメカニズムの校正のためにコピーの非常にハイファイと関連付けられるDNAの複製を生体内で含む。  ただし、DNAがPCRと同じように生体外で複製されるとき、コピーの誤り率はかなりより大きい。  最も広く利用されたポリメラーゼ、しかしTaq DNAポリメラーゼに' 5 'に、相談する準の3 exonucleaseが校正機能ない。  従ってDNAの複製の間に基礎misincorporationによる誤り率はTaqのために幾分高い: 重複の20の有効なサイクルを経たこの酵素を使用してPCRによって総合されたkbシーケンス1つのために、新しいDNAの繊維のおよそ40%は不正確なヌクレオチドを含んでコピーのエラー(16)に起因する。  従って、PCRの反作用が単一DNAシーケンスの拡大を含んでも、最終製品はほとんど一致の混合物、同一のDNAシーケンスである。  複製によるエラーにもかかわらず生体外で、総PCRの製品のDNAの配列は不正確なベースの結合が本質的に任意であり、1つ以上の繊維の1つの不正確なベースの貢献が正しいシーケンスがある繊維の巨大な大半からの貢献によって圧倒されるという事実による正しいシーケンスを与えるかもしれない。  ただし、PCRの製品がセルでクローンとして作られるべきなら行なうそれ以上の実験前に正しい(一致)シーケンスを、定めるために複数の個々のクローンは配列される必要がある場合もある。
もっと最近、PCRの反作用の間のDNAの複製の不義の問題は' 5 'に3 exonucleaseの作業を関連付けた代わりとなるheat-stable DNAポリメラーゼの使用によってかなり減った。  Pyrococcusのfuriosus (Pfu) DNAポリメラーゼおよびThermococcus Litoralis (出口)は' 5 'に準の3相談される校正のために広く利用されるようにexonucleaseの作業(18)によってなっている。  例えばPfuの生じるPCRの製品に、エラーのコピーによってもたらされる突然変異の多くの低レベルがある: 重複の20の有効なサイクルを経たDNAのkbセグメント1つのために、DNAの約3.5%は製品で運ぶ変えられたベース(16)を残す。

特定性を改善する新しいアプローチは認識に基づいてTaq DNAポリメラーゼがDNAの統合のための最適よりずっと低く温度でかなりの酵素の作業を保つこと開発された。  従って、部分的に単一の残されたテンプレート領域に無指定にアニールするプライマーは反作用がとりわけアニールされたプライマーの拡張のための72°Cに達する前に拡張である場合もある。  反作用が(高く達した後やっとDNAポリメラーゼが作動すれば>70°C)温度、非ターゲット拡大は最小化することができる(19,20)。  この「ホットスタート」のアプローチは高温の選択の管への必要な試薬の手動付加によって達成することができる。  ssDNAの結合蛋白質の付加はまた特定の拡大を高めるために報告された。  ユーザーフレンドリーのアプローチはDNAポリメラーゼの阻止か不活性化自体を使用することである。  Taq DNAポリメラーゼの阻止の2つのタイプはオリゴヌクレオチドの阻止(21)および抗体(22)の阻止を含んで試みられた。 両方のTaq DNAポリメラーゼの非常に特定のオリゴヌクレオチドの抑制剤は作り出された。  これらは40°Cの下で温度で選択式にDNAポリメラーゼの作業を禁じ、機能にホットスタートアプリケーションで示されていた。  また、1つはTaq DNAポリメラーゼに対して抗体を使用できる。 抗体は抗体はそれにより酵素を解放する55°Cより大きい、温度で変化することPCRの温度がそのような物になるまでDNAポリメラーゼを禁じる。  このタイプのホットスタートの状態へ不利な点がどんなにある。  この場合、1つはPCRで使用される各々の別の酵素のための抗体を必要とし、多数のPCRsのためにこれはかなり上がることができる費用。  ホットスタートの最も便利な形式は室温(temperature-sensitive突然変異体)で作動しないDNAポリメラーゼを修正すること、6-15分の95°Cの孵化の後だけで(23)ように再作動する。  

簡易性のために、PCRは広い応用範囲との普及した技術である
ダイレクトシーケンス、genomic、伝染性の微生物の検出タイプする、クローニング、DNA方法の本質的に3つの主要な利点によって決まるallelicシーケンス変化のサイト指示された突然変異誘発、出生前の遺伝病の研究および分析を含んで(1,7,13,16の):

速度および使い易さ:   PCRによるDNAのクローニングは少数の時間内の比較的短い時間で、行うことができる。  通常、PCRの反作用はおよそ30のサイクルから変性、統合を含み、自動化された熱cyclerで普通3 5分かかっていて個々のサイクルがステップを、reannealing各サイクル成っている。  これははっきり時間の週を取ることができる細胞に基づくDNAのクローニングに必要な時間より速い。  なお、PCRの反作用をセットアップすることはかなり容易であり、thermocycler機械の使用はまた容易である。  時間はオリゴヌクレオチドのプライマーのデザインそして統合に必要となるが、これはプライマーデザインのためのコンピュータ・ソフトウェアのアベイラビリティおよびカスタムオリゴヌクレオチドの急速な商業か学術の統合によって簡素化された。   PCRの状態の最適化はプライマーアニーリングの温度、マグネシウムの集中およびプライマー集中のような必要となるかもしれない。  ただし、いろいろなプライマーアニーリングの温度が同時にテストされるようにする勾配PCR機械の作成はこのステップに必要な時間を非常に減らした。  一度反作用のための最適の条件は、ずっと反作用単に繰り返すことができるそれから得られている(1,7,13,16)。 

感度:  PCRはターゲットDNAの微量からのシーケンス、単一セルの(24)からのDNAを増幅することができる。  そのような絶妙な感度は分子病因を調査する新しい方法をでき、タイプしている単一精液を使用して法医科学の多数のアプリケーションを、診断で、遺伝連結分析とサンプルがセルの微細な番号を含むかもしれない分子古生物学の調査の見つけた。 ただし、方法の極度な感度は調査中のサンプルの汚染を避けるために大きい心配がexternal DNAによって取られなければならないことを意味するオペレータ(1,7,13,16)からのセルの微量からのような。

強さ:  核酸ソースの広い範囲はPCRの拡大のための適したテンプレートである。  さまざまな種類からの浄化されたDNAsおよびソースは増幅された。  PCRはDNAが慣習的なDNAの隔離が問題となる媒体でひどく低下するか、または埋め込まれる材料からの特定のシーケンスの拡大を可能にすることができる。 その結果、それは再度分子人類学のために非常に適して、古生物学は調査する、考古学的から回復DNAの例えば分析は残る。 またホルマリン固定からのDNAを増幅することを正常に使用したまたはパラフィン埋め込まれた組織サンプルは分子病理学およびある場合によっては、遺伝連結にで重要なアプリケーションが調査する。  通常、PCRの拡大の成功はターゲットフラグメントが比較的豊富なとき最も大きい(1,7,13,16)。 

巨大な人気にもかかわらず、PCRに選択式に特定のDNAシーケンスをクローンとして作るための方法として一定の制限がある。 
特定DNAシーケンスの選択的な拡大を可能にする特定のオリゴヌクレオチドのプライマーを組み立てて、前シーケンス情報は通常必要である。  これは普通興味のDNA領域が部分的に前に特徴付けられてしまったことを、頻繁に次の前の細胞に基づくDNAのクローニング意味する。  ただし、ターゲットDNAに関する前DNAシーケンス情報のための必要性を減らしたりまた更に除くいろいろなアプローチは開発された。  前にuncharacterized DNAシーケンスは時々退化のオリゴヌクレオチドとのPCRを使用して遺伝子のメンバーまたはメンバーの前に特徴付けられてしまった反復的なDNAグループ少なくとも1ならクローンとして作ることができる。   場合によっては、ターゲットDNAに関する前シーケンス情報なしでPCRがextemely限られた量にあるDNAのソースからのDNAシーケンスのindiscriminateamplificationを許可するのに効果的に使用することができる。  従って、全ゲノムの拡大を保障するためにPCRは適用することができるがgenomic DNAライブラリから成り立っている個々のDNAのクローンを分ける方法の提供の細胞に基づくDNAのクローニングの利点を持っていない。
単一の反作用で得られるPCRの製品の量は細胞培養のボリュームの位取りしなさい細胞に基づくクローニングを使用して得ることができる量が可能であるよりはるかに限定されてまた。 PCRの反作用の効率はからテンプレートそして反作用を最適化するために必要となるが、製品の比較的少量だけ普通達成されるさまざまな要因に従ってにテンプレート変わる。
PCRの理論的な収穫が指数であるが、PCRの実益は大いにより少なくスキームが最大潜在性よりより少しと動作していることを示している。  例えば、各サイクルの製品の量は結局水平になる。  このプラトーは次の現象によって説明されるかもしれない。  最初に、テンプレートのいくつかは決して浄化および最初のthermocyclesの間に他の高分子から分離されるにDNAの壊れ目か障害を残して使用できる当然であるかもしれない。  2番目に、酵素の量は有限であり、結局作業は減るかもしれない。  3番目にdouble-stranded製品の集中がハイレベルに達するので、競争はテンプレート(PCRの製品)のアニーリングと補足のテンプレートの繊維(1,7,13)のreannealingの間でプライマーに増加する。
DNAのクローニング方法としてPCRの明らかなおよび何倍も大きい不利な点はクローンとして作ることができるずっとDNAシーケンスのサイズの範囲である。  クローンとして作られたDNAシーケンスのサイズが2 Mbに近づくことができるPCRによってクローンとして作られるDNAシーケンスを報告される細胞に基づくDNAのクローニングとは違ってこのスケールのロー・エンドに0.1の5 kbのサイズの範囲に、頻繁に普通あった。  DNAの小さいフラグメントは通常PCRによって望ましい製品の長さが増加すると同時に効率的な拡大を得ることはますます困難になるどんなに容易に増幅することができる。  バーンズはDNAのPCRの拡大に(25)ターゲット長さの限定を認識した。  彼はハイファイの長いPCRを行なうために3 ' - exonucleaseの作業(Pfuの出口表わすthermostable DNAポリメラーゼの非常に低レベルとのexonuclease自由のの高レベルの組合せ、Taq DNAポリメラーゼ、Klentaq1のNターミナル削除の突然変異体を、または深い出口)を使用した。 バクテリオファージlambdaの少なくとも35 kbはlambda DNAのテンプレートの1 NGからの高い収穫に増幅することができる。  この方法の使用は高められたベースペアの忠誠、機能プライマーとしてPCRの製品を使用するおよびターゲットフラグメントの最大収穫をもたらした。  他の条件はphaga lambda DNA (26)からの人間のgenomic DNAからのベータglobinの遺伝子クラスタの22までkbの拡大を含むより長いターゲットの有効な拡大のために、および42までkb識別された。  これらののための条件は長いPCRsによって含まれていた高められたpHの付加およびグリセロールのジメチルスルフォキシド、拡張3 ' - 5に' - exonucleaseを所有している、または「校正使用変性の時間を」作業減らした二次thermostable DNAポリメラーゼの時間増加した、および。  「長いPCR」のプロトコルは特定のプライマーアニーリングのためにポリメラーゼの低レベルおよび温度および塩の状態を使用することによってgenomic DNAのターゲットに必要な特定性を維持した。  10-40 kbのDNAシーケンスを増幅する機能はgenomicマップし、配列にPCRの速度そして簡易性を持って来、分子遺伝学(26)の調査を促進する。  通常、長距離PCRのための条件は2ポリメラーゼシステムと基準状態への修正の組合せを含む。  これは校正のメカニズム(16)として役立つ' 5 'へのDNAのポリメラーゼそして3 exonucleaseの作業の最適のレベルを提供する。

Thermocyclersは1986年に自動的に調整するPCRの循環のための温度導入された(図6)。  PCRの試薬の前進に加えて、自動化された熱循環とPCRの製品を分析するための新しい器械は発達した。  新しい熱cyclersは暖房の率を、修正された反作用の容器への冷却し、熱伝達高めた。  第一世代の熱cyclers (また更に水浴室および暖房のブロックによって)取り扱われた反作用の容器は標準プラスチックmicrofugeの管だった。  薄い毛管管のPCRの拡大は20sへの急速な熱循環、およびDNAの統合を可能にした。  達成されるこれらのシステムの温度変化の速度はPCRのサイクルの各々の個々のステップのための温度の最適の精密な定義を可能にした。   新しい世代の熱cyclersにまたより多くのサンプルを取り扱い、より精密な熱プロフィールがあり、そしてプログラム可能な(13)である。 

PCRの広まったアプリケーションへの最少の認められた貢献の1つはオリゴヌクレオチドのずっと統合のための信頼できる自動化された化学の開発である。  最近まで、単一のオリゴヌクレオチドの構築は巧みな有機性化学者によってだけ行うことができる相当なタスクだった。  ここでどちらか商業か学術ソースから技術者かオリゴヌクレオチド自身によって作動させることができるオリゴヌクレオチドのシンセサイザを購入することは可能である。  マルチプレックスオリゴヌクレオチドの統合機械は統合(27,28)の総費用の削減の目標と組み立てられた。  オリゴヌクレオチドが終局PCRの製品を定義するので、準備ができた供給がない時、PCRが(13)を今日得てしまった広い受諾を楽しまなかろうということには疑わしい点がある。 

研究者はPCRのプライマーのデザインが困難、信頼できなかったことを前もって同意した。  計算機プログラムは設計基準すべてを注意して取るために案出された。   プライマーデザインのために書かれている最初のプログラムの1つはAtari ST (29)のデジタル研究の宝石(図形環境マネージャ)の実施を利用したオリガだった。  オリガは2つのプライマーシーケンスの同時分析を可能にするポリメラーゼの連鎖反応(PCR)にとりわけ適した。  オリガの利点はPCRの最適化およびオリゴヌクレオチドの統合で実行された労働者のための複数の有用な「仕上げ」のツール、また直接繰り返し、二次構造およびプライマー二量化に1つのプログラム解析で提供したことだった。   Whiteheadの協会のPrimer3プログラムは最も信頼でき、最も多目的なツール現在利用できる(30)であると今考えられる。

PCRsは百万倍以上までに今ことができDNAのフラグメントの拡大を長さに行う最初の豊富複数のkilobasesまで可能にする。  プロシージャは非常にautomatable、製品解析にthermocylingの開始からのちょうど少数の時間を必要とする。  これは前に事実ではなかったし、PCRを行うための実用的な条件は方法(13)の最初の原稿以来非常に簡素化されていた。  現在、最初の連結器のほとんどまたはPCRの非能率は(8)解決された。   270,000以上の記事(31)を含むためになお、PCRは拡大した。

  しかしポリメラーゼの連鎖反応は生体外のDNAの拡大のための最も広く利用された方法である熱変性か2つのDNAの繊維を分けるためにthermocyclingを必要とする。  生体内で、DNAはさまざまなアクセサリ蛋白質が付いているDNAポリメラーゼによって複製される。   DNAのhelicaseは、DNAポリメラーゼのアクセサリ蛋白質セルの中のデュプレックスDNAを分けるために機能する。  Vincentは等生体内の複製のメカニズムをまねることによって(32)新しい生体外の等温DNAの拡大方法を案出した。  Helicase依存した拡大は(持っていた)プライマー交配のためのsingle-strandedテンプレートを生成するのにDNAのhelicaseを利用する。  それに続くプライマー拡張はDNAポリメラーゼによってそれから触媒作用を及ぼされる。  必要としない高いthermocyclerを持ち、こうしてPCRは事実上どこでも行われるかもしれない。  さらに、それは簡単な反作用スキームを持っていることおよび全体のプロセスのための1つの温度で行うことができる本当の等温の反作用であることによって他の等温DNAの拡大方法上の複数の利点がある。 フィールドでそしてポイントの心配(32)で使用される簡単なポータブルDNAの診断装置の開発で提供の大きい約束を持っていた。

PCRを定義する最も簡単で、最も便利な方法が技術としてあることを言われる。  ただし、そのような類別はPCRの開発の歴史を長年かけてPCRの理論および技術の最適化の後ろの考えに貢献される同様に多くの個人除去する。  次の最も簡単な答えはポリメラーゼの連鎖反応の発明家として個人を名前を挙げることである。  Karry MullisはPCRの彼の発見のための1993年に化学のためのノーベル賞を与えられた。  ただし、この発見はこの困惑をロック解除することに貢献するかもしれない多くの科学者の中で争われる。
実験システムではたらくことをなしたまでPCRがなかったことがまた言われた。  これを念頭において、ただ概念の思考は十分ではない; 概念は方法(33)に正常に入ったにちがいない。
PCRどうかしてまたはいつか取り替えられるかもしれないという疑い、および可能性に関して疑いがPCRの最終的な創作者に関してあるが少しが疑いPCRが分子生物学および生命の調査の短い時間に作成した影響ある。

参照

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