版権の©の分子端末2006年
興味の遺伝子か蛋白質を特徴付けたいと思うとき最初に機能を調査しなければならない。 この分子時代では、興味の遺伝子のcDNAを得ることは困難ではない。
cDNAを蛋白質として表現するため、ie。 組換え蛋白質、1は組換えの浄化された蛋白質を使用してそれから容易に機能調査を行うことができる。
浄化された蛋白質があれば行なうことができる:
組換え蛋白質の表現のための2つの主システムがある。 cDNAをクローンとして作られて得れば、蛋白質をどこに増幅したいと思うか決定しなければならない。 これはprokaryotic (細菌)またはeukaryotic (通常イーストか哺乳類セル)システムである。 システムの選択はエシェリヒア属大腸菌で作用するおよびイーストか哺乳類システムを最もよく使用する他がある異なった促進者のでどのベクトルにcDNAをクローンとして作る必要があるか決定する。
従って蛋白質の表現システムが使用するためにか。
Prokaryotic組換え蛋白質の表現システムに複数の利点がある。 これらはcDNAをクローンとして作れば細菌システムから蛋白質を得るためにあなたが長く待つ必要がない非常に急速なセル成長の意味および文化の容易さを、含んでいる。 表現はIPTGを使用して細菌蛋白質の表現システムで容易に誘導することができる。 また、浄化はprokaryotic表現システムでかなり簡単であり、組換え蛋白質の表現のために使用できる商業キットの茄多がある。
一方で、機能か酵素の調査のために蛋白質を使用する必要があればprokaryoticシステムはほとんどの蛋白質が包含ボディで不溶解性になる、機能蛋白質として回復非常ににくいと同時に問題。 なお従ってすべてのポスト翻訳の修正が興味の細菌そして蛋白質によって追加されなければ、ほとんどは機能ではないかもしれない。 酵素の調査はこうしてunfruitfulであるかもしれない。
Eukaryotic遺伝子はprokaryoticセルにprokaryoticベクトルの管理下に表現される時でさえ、実際に「家庭で」ない。 1つの理由はエシェリヒア属大腸菌のセルが局外者として頻繁にクローンとして作られたeukaryotic遺伝子の蛋白質の製品を認識し、破壊することである。 別のものはprokaryotesがeukaryotesがのとposttranslationalの修正の同じ種類を遂行しないことである。 例えば、eukaryoticセルの砂糖に通常つながれる蛋白質は裸蛋白質として細菌にクローンとして作られたとき表現される。 これは抗体への蛋白質の作業か安定性、または少なくとも応答をもたらすことができる。 深刻な問題は細菌のセルの内部がeukaryoticセルの内部としてeukaryotic蛋白質の適切な折りたたみを促すようにないことである。 頻繁に、結果は不適当に、クローンとして作られた遺伝子の作動しない製品折られる。
蛋白質の表現のためのEukaryoticシステムは下記のものを含んでいる:
これらのシステムはすべて組換え蛋白質の表現のための大きいeukaryoticシステムである。 eukaryotic蛋白質の表現システムの利点は表現の非常に高いレベルを得ることができるという事実を含んでいる。 蛋白質は彼のを含むベクトルに含まれている特別な札、Mycおよび他の札を使用して浄化し易い。
媒体に蛋白質を分泌するプラスミッドを購入できる。 従ってシステムを育て、セルを分離させないで媒体を集め続けることができる。 心配する包含ボディがないし、蛋白質にそのままなポスト翻訳の修正がある。 これらは蛋白質や蛋白質蛋白質の相互作用の機能を調査すれば重要である。
eukaryotic蛋白質の表現システムの不利な点はeukaryoticセルがprokaryoticセルより遅く育つという事実を含んでいる。
表現のベクトルの主関数はより多くの製品よりよいの遺伝子の製品を通常もたらすことである。 従って、表現のベクトルは非常に強い促進者が通常装備されている; 理論的根拠はことであるより多くのmRNAが作り出されれば、より多くの蛋白質の製品は作られる。 1人のそのような強い促進者はtrp (トリプトファンのoperon)の促進者である。 それはptrpL1を含む複数の表現のベクトルのための基礎を、形作る。 それはtrp促進者またはオペレータ領域をリボゾームの結合サイトに先行させてもらい表現のベクトルとしてClaIのサイトに外国の遺伝子を挿入することによって直接使用することができる。 また、trpの調節領域はClaIおよびHindIIIとによって切り、別のベクトルに表現されるべき遺伝子の前の挿入すること「ポータブル」にそれを作ることができる
私達がそれを表現して準備ができているまで通常クローンとして作られた遺伝子をrepresedおくことは有利である。 1つの理由は細菌でたくさん作り出されるeukaryotic蛋白質が有毒である場合もあることである。 これらの蛋白質が実際に有毒でなくても、細菌の成長と干渉することオーシュのすばらしいレベルに造り上げてもいい。 いずれにしてもクローンとして作られた遺伝子が絶えずつけられて残る、遺伝子に耐えている細菌は十分に大きい集中に決して有意義な量の蛋白質の製品を作り出すにはならない。 解決はクローンとして作られた遺伝子をうんざりさせることができる誘引可能な促進者の下流にそれを置くことによって消しておくことである。 ラックの促進者はある程度は誘引可能であり、推定上総合的な誘因物のisopropylthiogalactoside (IPTG)によって刺激されるまで残る。 ただし、ラックのリプレッサーによって引き起こされる抑圧は不完全であり、クローンとして作られた遺伝子の表現は誘因物がない時観察される。 この問題のまわりの一方通行はpBSがように、自身のlacIの遺伝子を運ぶプラスミッドかphagemidに私達の遺伝子を表現することである。 余分なリプレッサーはそのようなベクトルによって私達がIPTGとのそれを誘導して準備ができているまでおく私達のクローンとして作られた遺伝子を消して作り出した。 もう一つの作戦はλのバクテリオファージの促進者PLとして堅く制御された促進者を使用することである。 この促進者またはオペレータシステムとの表現のベクトルはtemperature-sensitive λのリプレッサーの遺伝子(c1857)に耐える宿主細胞にクローンとして作られる。 私達がこれらのセルの温度を比較的低い(保つ限り32°C)は、リプレッサー作用し、表現は起こらない。 ただし、私達がnonpermissiveレベル(42ºC)に温度を上げるとき、temperature-sensitiveリプレッサーはもはや作用できないし、クローンとして作られた遺伝子は誘導される。
ほとんどの表現のベクトルが動作するとき、融合蛋白質を作り出す。 これは最初にで挿入された遺伝子の天然産物が作られないので不利な点のようであるかもしれない。 ただし、融合蛋白質の余分アミノ酸は蛋白質の製品の浄化の多大な助力である場合もある。
oligoヒスチジンの表現のベクトルを、そのうちの一つ持っている商品名のpTrcHisを考慮しなさい。 これらは6ヒスチジンの伸張を符号化する多重クローニングサイトの上流で短いシーケンスをちょうど有する。 従って、そのようなベクトルに表現された蛋白質はアミノの端に6ヒスチジンが付いている融合蛋白質である。 私達はなぜ私達の蛋白質に6ヒスチジンを接続したいと思うか。 このようなOligoヒスチジン領域にニッケルのような金属のための高い親和性がある、従って私達はニッケルのアフィニティー・クロマトグラフィーを使用してそのような領域がある蛋白質を浄化してもいい。 この方法の美は簡易性および速度である。 細菌が融合蛋白質を作った後、私達はそれらを単に分離させたり、ニッケルのアフィニティー・カラムにsrudeの細菌のエキスを追加したり、すべての自由な蛋白質を洗浄したり、そしてヒスチジンまたはヒスチジンのアナログの呼出されたイミダゾールが付いている融合蛋白質を解放する。 このプロシージャは私達が1つのステップだけの純粋な融合を本質的に収穫することを可能にする。 これはどの自然な蛋白質でもoligoヒスチジン領域があれば非常に少数、従って私達の融合蛋白質が本質的にコラムに結合する唯一のものであるので可能である。
私達はoligoヒスチジンの札のなしの私達の蛋白質がほしいと思えば何か。
これらのベクトルのデザイナーは思慮深くそれを除去する方法を提供した。 多重クローニングサイトの直前、蛋白質分解酵素のenterokinaseによって認識されるアミノ酸の伸張のためのコーディング領域がある。 従って私達は2部に融合蛋白質を裂くのにenterokinaseを使用してもいい: 私達がほしい蛋白質およびoligoヒスチジンの札。 enterokinaseによって認識されるサイトは非常にまれであり、私達の蛋白質にあるというチャンスは些細である。 従って、私達の蛋白質は私達がoligoヒスチジンの札を除去していると同時にの上で切り刻まれるべきではない。 ほしければ、私達はニッケルのコラムを通して興味の蛋白質からoligohisitidineフラグメントを分けるためにenterokinase裂かれた蛋白質をもう一度実行してもいい。
λのバクテリオファージはまた表現のベクトルのための基礎として役立った; 設計されている1つはとりわけこのためにλgt11である。 このバクテリオファージはlacZの遺伝子に先行しているラックの調節領域を含んでいる。 クローニングサイトはlacZの遺伝子の内にある、従ってこのベクトルに挿入された遺伝子の製品はBガラクトシダーゼのリーダーが付いている融合蛋白質である。 表現のベクトルλgt11はcDNAライブラリを作り、選別するための普及した手段になった。 λgt11は私達が右の蛋白質の表現のためのクローンのグループを直接選別することを可能にする。 このプロシージャに必要な主要な原料はλgt11のcDNAライブラリおよび興味の蛋白質に対して指示される抗血清である。 私達はさまざまなcDNAの挿入と私達のλのバクテリオファージをめっきし、硝酸セルロースのようなサポートに各クローンが解放する蛋白質にしみを付ける。 私達が各プラクから硝酸セルロースに蛋白質を転送したら、私達は私達の抗血清と厳密に調べる。 次に、私達は黄色ブドウ球菌からの分類された蛋白質Aを使用して特定のプラクからの蛋白質に、区切られる抗体を捜す。 この蛋白質は抗体に堅く結合し、硝酸セルロースの対応する点を分類する。 私達は放射線写真法またはphosphorimagingによってこのラベルを検出し、そして私達のマスター版に行き、そして対応するプラクを選ぶ。 興味の蛋白質ではなく自体をことをことに私達検出している融合蛋白質注目しなさい。 なお私達が全cDNAをまたはないクローンとして作ったら、重要ではない。 私達の抗血清はコーディング領域がBガラクトシダーゼのコーディング領域と同じオリエンテーションおよびリーディング・フレームでクローンとして作られる限り、私達の蛋白質の複数の異なった一部分と反応する抗体の混合物、そう部分的な遺伝子するである。
速い組換え蛋白質の表現の検討のために見なさい:
組換え蛋白質システム
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