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組換え蛋白質の表現

版権の © 分子端末2006 年

興味の遺伝子か蛋白質を特徴付けたいと思うとき最初に機能を調査しなければならない。この分子時代では、興味の遺伝子のDNA を得ることは困難でない。

蛋白質としてDNA を、ie. は組換え蛋白質表現するためには、1 それから容易に組換えの浄化された蛋白質を使用して機能調査を行うことができる。

浄化された蛋白質があれば行なうことができる:

• 蛋白質蛋白質の相互作用は実験する
• 酵素の動力学
• 蛋白質の機能調査
• 構造調査- 蛋白質の結晶化、蛋白質の構造およびNMR を含む…。
• それ以上の実験のための抗体を作るのにまた蛋白質を使用できる。

組換え蛋白質の表現のための2 つの主システムがある。DNA をクローンとして作られて得れば、蛋白質を増幅したいと思うどこで決定しなければならない。これはprokaryotic (細菌) またはeukaryotic (通常イーストまたはmammalian セル) システムである。システムの選択はE.Coli で作用するおよびイーストかmammalian システムを最もよく使う他がある異なった促進者のでどのベクトルにDNA をクローンとして作る必要があるか決定する。

そう蛋白質の表現システムが使用するためにか。

 蛋白質の表現のためのシステム

Prokaryotic 蛋白質の表現システム

Prokaryotic 組換え蛋白質の表現システムに複数の利点がある。これらはDNA をクローンとして作れば細菌システムから蛋白質を得るためにあなたが長く待つ必要がない非常に急速なセル成長の意味及び文化の容易さを、含んでいる。表現はIPTG を使用して細菌蛋白質の表現システムで容易に誘導することができる。また、浄化はprokaryotic 表現システムでかなり簡単であり、組換え蛋白質の表現のために使用できる商業キットの茄多がある。

一方では、機能か酵素の調査のために蛋白質を使用する必要があればprokaryotic システムはほとんどの蛋白質が包含ボディで不溶解性になる、機能蛋白質として回復し非常ににくいと同時に問題。なお従って�&スト�&訳の修正ないすべてが興味の細菌そして蛋白質によって追加されなければ、ほとんどは機能でないかもしれない。酵素の調査はこうしてunfruitful であるかもしれない。

Eukaryotic 表現システム

Eukaryotic 遺伝子はprokaryotic セルの “ホームに” prokaryotic ベクトルの制御の下に表現される時でさえ、実際にない。  1 つの理由はE. 大腸菌のセルが局外者として頻繁にクローンとして作られたeukaryotic 遺伝子の蛋白質プロダクトを確認し、破壊することである。  別のものはprokaryotes がeukaryotes がのと同じ一種のposttranslational の修正を遂行しないことである。  例えば、eukaryotic セルの砂糖に通常つながれる蛋白質は裸蛋白質として細菌にクローンとして作られたとき表現される。  これは抗体への蛋白質’s の作業か安定性、または少なくとも応答をもたらすことができる。  より深刻な問題は細菌のセルの内部がeukaryotic セルの内部としてeukaryotic 蛋白質の適切な折りたたみを促すようにないことである。  頻繁に、結果は不適当に、クローンとして作られた遺伝子の作動しないプロダクト折られる。 

蛋白質の表現のためのEukaryotic システムは下記のものを含んでいる:

• イースト
• mammalian セル
• baculovirus のセル(昆虫)

これらのシステムすべては組換え蛋白質の表現のための大きいeukaryotic システムである。
eukaryotic 蛋白質の表現システムの利点は表現の非常にハイレベルを得ることができるという事実を含んでいる。蛋白質は彼のを含むベクトルに含まれている特別な札、Myc および他の札を使用して浄化し易い。

媒体に蛋白質を分泌するプラスミッドを購入できる。従ってシステムを育て、セルを分離させないで媒体を集め続けることができる。約心配する包含ボディがあり、蛋白質にそのままな�&スト�&訳の修正がある。これらは蛋白質や蛋白質蛋白質の相互作用の機能を調査すれば重大である。

eukaryotic 蛋白質の表現システムの不利な点はeukaryotic セルがprokaryotic セルより遅く育つという事実を含んでいる。

強い促進者との表現のベクトル

表現のベクトルの主関数はより多くのプロダクトよりよいの遺伝子のプロダクトを通常もたらすことである。  従って、表現のベクトルは非常に強い促進者が通常装備されている; 理論的根拠はことであるより多くのmRNA が作り出されれば、より多くの蛋白質プロダクトは作られる。
1 人のそのような強い促進者はtrp (トリプトファンのoperon) の促進者である。  それはptrpL1 を含む複数の表現のベクトルのための基礎を、形作る。  それはtrp promoter/operator 領域をリボゾームの結合サイトに先行させてもらい表現のベクトルとしてClaI のサイトに外国の遺伝子を挿入することによって直接使用することができる。代わりに、trp の調節領域はそれをClaI 及び “HindIII” と携帯用に切り、別のベクトルに表現されるべき遺伝子の前の挿入することによって作ることができる

誘引可能な表現のベクトル

私達がそれを表現して準備ができているまでクローンとして作られた遺伝子を保つことは通常有利represed である。  1 つの理由は細菌でたくさん作り出されるeukaryotic 蛋白質が有毒である場合もあることである。  これらの蛋白質が有毒実際にでなくても、細菌の成長と干渉することオーシュのすばらしいレベルに造り上げることができる。  意味を持った量の蛋白質プロダクトを作り出すにはクローンとして作られた遺伝子が絶えずつけられて残るいずれにしても、遺伝子に耐える細菌は十分に大きい集中に決して育たない。  解決はクローンとして作られた遺伝子を消すことができる誘引可能な促進者のそれを下流に置くことによって消しておくべきである。
ラックの促進者は誘引可能、総合的な誘因物のisopropylthiogalactoside (IPTG) によって刺激されるまで推定上残ったある程度はである。  但し、ラックのリプレッサーによって引き起こされる抑圧は不完全であり、クローンとして作られた遺伝子の表現は誘因物がない時観察される。  この問題のまわりの一方通行はpBS がように、自身のlacI の遺伝子を運ぶプラスミッドかphagemid に私達の遺伝子を表現するべきである。  余分なリプレッサーはそのようなベクトルたくわえによって私達がIPTG とのそれを誘導して準備ができているまで消された私達のクローンとして作られた遺伝子を作り出した。
もう一つの作戦はphage 促進者PL として堅く制御された λ 促進者を使用することである。このpromoter/operator システムとの表現のベクトルは温度敏感なリプレッサーの遺伝子(c1857) に耐える λ 宿主細胞にクローンとして作られる。  私達がこれらのセルの温度を比較的低い(32.C) 保つ限り、リプレッサーは作用し、表現は起こらない。  但し、私達がnonpermissive レベルに温度を(上げるとき42ºc) は、温度敏感なリプレッサーもはや作用でき、クローンとして作られた遺伝子は誘導される。

融合蛋白質を作り出す表現のベクトル

ほとんどの表現のベクトルが作動するとき、融合蛋白質を作り出す。  これは最初にで挿入された遺伝子の天然産物が作られないので不利な点のようであるかもしれない。  但し、融合蛋白質の余分アミノ酸は蛋白質プロダクトの浄化の大きいヘルプである場合もある。

1 つに商品名のpTrcHis があるoligo ヒスチジンの表現のベクトルを考慮しなさい。  これらは6 ヒスチジンの伸張を符号化する多重クローニングサイトの短いシーケンスをちょうど上流に有する。  従って、そのようなベクトルに表現された蛋白質はアミノの端に6 ヒスチジンが付いている融合蛋白質である。  私達はなぜ私達の蛋白質に6 ヒスチジンを接続したいと思うか。  このようなOligo ヒスチジン領域にニッケルのような金属のための高い親和性がある、従って私達はニッケルのアフィニティー・クロマトグラフィーを使用してそのような領域がある蛋白質を浄化できる。  この方法の美は簡易性および速度である。  細菌が融合蛋白質を作った後、私達はそれらを単に分離させたり、ニッケルのアフィニティー・カラムにsrude の細菌のエキスを追加したり、自由な蛋白質すべてを洗浄したり、そしてヒスチジンまたはヒスチジンのアナログの呼出されたイミダゾールが付いている融合蛋白質を解放する。  このプロシージャは私達が1 つのステップだけの純粋な融合を本質的に収穫することを可能にする。  これはどの自然な蛋白質でもoligo ヒスチジン領域があれば非常に少数、従って私達の融合蛋白質がコラムに結合する唯一のもの本質的にであるので可能である。

私達はoligo ヒスチジンの札の自由な私達の蛋白質がほしいと思えば何か。 

これらのベクトルのデザイナーは思慮深くそれを除去する方法を提供した。  多重クローニングサイトの直前、蛋白質分解酵素のenterokinase によって確認されるアミノ酸の伸張のためのコーディング領域がある。  2 部に融合蛋白質を裂くのにそう私達はenterokinase を使用できる:  私達によってがほしい蛋白質およびoligo ヒスチジンの札。enterokinase によって確認されるサイトは非常に稀であり、私達の蛋白質にあるというチャンスは些細である。  従って、私達の蛋白質は私達がoligo ヒスチジンの札を除去していると同時にの上で切り刻まれるべきでない。  ほしければ、興味の蛋白質からoligo-hisitidine のフラグメントを分けるために私達はニッケルのコラムを通してenterokinase 裂かれた蛋白質をもう一度ランすることができる。

λ バクテリオファージはまた表現のベクトルのための基礎として役立った;  この目的のためにとりわけ設計されている1 つはgt11 λである。  このバクテリオファージはlacZ の遺伝子に先行しているラックの調節領域を含んでいる。  クローニングサイトはlacZ の遺伝子の内にある、従ってこのベクトルに挿入された遺伝子のプロダクトはB ガラクトシダーゼのリーダーが付いている融合蛋白質である。
表現のベクトル λgt11 はDNA ライブラリを作り、選別する為の普及した車になった。  λgt11 は私達が右の蛋白質の表現のためのクローンのグループを直接選別することを可能にする。  このプロシージャに必要な主要な原料はgt11 のDNA ライブラリ λ及び興味の蛋白質に対して指示される抗血清である。
私達は様々なDNA の λ 挿入と私達のバクテリオファージをめっきし、硝酸セルロースのようなサ�&ートに各クローンによって解放される蛋白質にしみを付ける。  私達が各プラクから硝酸セルロースに蛋白質を転送したら、私達は私達の抗血清と厳密に調べる。  次に、私達は黄色ブドウ球菌からの分類された蛋白質A を使用して特定のプラクからの蛋白質に、区切られる抗体を捜す。  この蛋白質は抗体に堅く結合し、硝酸セルロースの対応する点を分類する。  私達は放射線写真法またはphosphorimaging によってこのラベルを検出し、私達のマスター版に次に行き、そして対応するプラクを選ぶ。  興味のことに私達検出している蛋白質ではなく自体ことを融合蛋白質を注目しなさい。  なお、それは私達が全DNA をまたはないクローンとして作ったら重要でない。  私達の抗血清はコーディング領域がB ガラクトシダーゼのコーディング領域と同じオリエンテーションおよびリーディング・フレームでクローンとして作られる限り、私達の蛋白質の複数の異なった一部分と反応する抗体の混合物、そう部分的な遺伝子するである。

速い組換え蛋白質の表現の検討については見なさい:

組換え蛋白質システム

版権の © 分子端末2006 年