再PCR 問題

[マリーナNtika]

みなさん、こんにちは。

特定のプラスミッドに私の遺伝子をクローンとして作る私は可能にするために遺伝子を増幅し、同時に�&イント突然変異を、最終目的の興味の特定の酵素との消化力をもたらすことを、試みている。

私が必要とする�&イント突然変異が5 (私がターゲットプラスミッドのATG のフレームにとどまる必要がある原因をより適切なサイトがプライマー設計すると、見つけることができなかった) 私が2 つの前方プライマーを設計した、3 つの�&イント突然変異との第1 および最初の前方に一致させ、残りの2 つの突然変異をもたらす第2 であるので。両方の私を組み合わせるのに私は同じ逆のプライマーを転送する使用する。

最初のペア(前方プライマーA および逆のプライマー) の働かせた公正な罰金、私は私がほしかったプロダクトを、容易にそしてかなり明確得た(プロフィールを最適化した後私は1 つのバンドしか、右の1 得なかった) 。但し、テンプレートおよびプライマー(前方プライマーB および逆のプライマー) の第2 ペアを使用することとして前の生じるプロダクトを使用して再PCR の間に、私は強い期待されたものより低い2 つのバンド、両方非常におよび両方をかなり得る。MgCl2 の高い集中と、私は第3 バンド(望ましい1) をまた得たが、非常にかすかである。私はそれがプライマーによって... 反応しなかったテンプレートのDNA の部分またなら確実であることができない

rePCR のための量のテンプレートは1ul である。

プライマーの両方のペアのためのアニーリングの温度は64C であるが、私に行った66 まで、まだ、最初ペア作業、二番目にないあり。

また、速いノート: 互い違いの方法による突然変異をもたらすか、またはクローニングプロシージャに別の酵素を選ぶことはオプションでない。

、糸口および提案は大抵歓迎されている。

長い�&ストおよびthanx のために残念前もって。

[kmunson779]

第2 反作用のためにテンプレートとして最初PCR プロダクトの1 つのUL を使用したことを正しく読んでいる私はあるか。これは私にDNA のひどいロットのようにようである。

どのように2 つのPCR のステップ間のDNA を浄化したか。どの位DNA を(モルかグラムによって) 第2 PCR の反作用に追加しているか。

何サイクルを2 つの反作用のためにランしているか。

私はあなたが予備手段を使用できないが確認するために最初のプロダクトをクローンとして作る鈍終りの価値があるかもしれない発言知っている進むことを前に正しい突然変異を有することを。

それはまたあなたが同じプライマーと再主な試みることを有するかもしれない問題を避けるためにあなたが最初のPCR の反作用のために増幅したいと思う領域の外の別の逆のプライマーを設計する価値があるかもしれない。

[oBWhat]

はい通常私達はPCR の組合せもまた反作用を禁じることができるので、浄化された水の10ul のPCR の反作用の1uL を薄くし、次に別のPCR のためにそれの1ul を使用する。

[マリーナNtika]

kmunson779 によって最初に 掲示されて

第2 反作用のためにテンプレートとして最初PCR プロダクトの1 つのUL を使用したことを正しく読んでいる私はあるか。これは私にDNA のひどいロットのようにようである。

どのように2 つのPCR のステップ間のDNA を浄化したか。どの位DNA を(モルかグラムによって) 第2 PCR の反作用に追加しているか。

何サイクルを2 つの反作用のためにランしているか。

私はあなたが予備手段を使用できないが確認するために最初のプロダクトをクローンとして作る鈍終りの価値があるかもしれない発言知っている進むことを前に正しい突然変異を有することを。

それはまたあなたが同じプライマーと再主な試みることを有するかもしれない問題を避けるためにあなたが最初のPCR の反作用のために増幅したいと思う領域の外の別の逆のプライマーを設計する価値があるかもしれない。

よく、私は第2 ものへ進む前に実際に最初のPCR プロダクトを浄化しなかった、私のバンドを非常に明確であり引き起すことは、私に他のプロダクト、か汚れがなかった。但し、私は万が一non-visible バンドもまた増幅されれば再度試み、ゲルの抽出を通して第2 PCR のためのテンプレートを得ることを計画する。私が第2 PCR のために使用するテンプレートは約10-30 NG である。私は40 のサイクルをランする。

不運にも、私に設計し直す時間が及び順序のプライマー、私が9 月の私の免状作業を示さなければならないまだある特定の表現のベクトルに第2 クローニング部品を(フラグの遺伝子と) 及びそれから全遺伝子(フラグ最初の遺伝子) なり、クローンとして作られなければし、大規模の分離をそして次に生体内で行く有する原因がないし。私のスケジュールは非常に堅い!!! プロジェクトの悪い資金に加える時間のこの欠乏は、代わりとなる方法を追求する私の無力をもたらす。私が私の分離すべてを非常に時間のかかる古い作られた方法することを、ことを私持っていないキットを使用する機能を想像しなさい。

とにかく、応答を本当にありがとう、oBWhat が(余りにありがとう) 提案する、私の最初プロダクト1:10 年を薄くし、またテンプレートとしてこれを使用することを試みることを試み... どのように行くか見るように私もまた