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樹液のエビのアルカリホスファターゼのプロトコル

エビのアルカリホスファターゼか樹液は、核酸のdephosphorylating RNA またはDNA の端からの’ 5 つの隣酸塩のdephosphorylation に触媒作用を及ぼす酵素である。

de de-phosphorylated ベクトルを使用しようとしたらPCR プロダクトにまたプライマー自由な端のホスファターゼがない注目し、従ってことにクローニング前にphosphorylated ある必要がありなさい!

従って樹液は不安定な温度である容易にCIP と比較されるこの酵素をである(!) 非活動化できる。樹液は15 分の65.C 水浴室の孵化と非活動化させる。

事実上反作用を得ない。樹液は少なくとも10mM のMgCl2 を(必要とするが、エビのアルカリホスファターゼの最適の酵素作業は20-25mM のMgCl2 にあり、) pH 8.0 でよく働く。

dephosphorylate 1 にDNA のpmol は終了する

DNA の端(3 kb のプラスミッドの2.5 ug) のdephosphorylate 1 のpmol 、なぜならあなたが必要とする37.C の1hr に:

5' 突出部分のための樹液の0.1 単位、鈍いのための0.2 単位および3' 余分のための0.5 単位はハングする。
酵素は1 単位UL につき来る、従って安全であることは2 ug のためにapprox.0.5 単位を使用できる。

先端: 樹液の酵素は制限のダイジェストに直接追加することができる! 従って終り分類する1 つの単一の管でちょうど適切な試薬を追加することによって制限の酵素の消化力、dephosphorylation’ 、酵素不活性化、ligation または5 を含む全進行は行うことができる。これは時間を節約し、有効であることを可能にする!

トラブルシューテ-ィングの樹液のエビのアルカリホスファターゼか。

エビのアルカリホスファターゼ及びDNA のクローニングフォーラムでそれについての �&ストの質問論議すれば !

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