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制限の酵素の消化力

制限の酵素

©2006 分子端末

制限の酵素及び消化のDNA の専門家になる方法の情報!

制限の酵素の背景

制限の酵素(か制限のendonucleases は) 2 つの壊れ目の作成によってdouble-stranded DNA を切る酵素、二重螺旋形の隣酸塩バックボーンのそれぞれによって1 である。酵素はDNA のベースを損なわないでこれをする。酵素がDNA を壊すが、化学結合はDNA のリガーゼとして知られている他の酵素によって改良することができる。従って、異なった染色体または遺伝子からのDNA の制限のフラグメントは一緒にligated でき端をである補足提供する。

 

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分子生物学の制限の酵素の実用性

DNA が処理できるおよび異なったDNA の部分は今想像されるの前の開発された新しい研究分野決して一緒に接続できないという事実。分子生物学の方法の多数は制限の酵素に今日頼る。"制限" はこれらの酵素が細菌の特定のバクテリオファージ("ウイルス ") の伝染を制限したようであるE. 大腸菌でinitally 検出されたという事実から得られる。制限が酵素ウイルス伝染に抵抗し、ウイルスシーケンスの除去と助けるために細菌によって展開するホストの防衛メカニズムおよび他の有機体であることを信じられる。

1978 年に、薬のためのノーベル賞はWerner Arber 、ダニエルNathans および組換えDNA 技術の開発をもたらす制限のendonucleases の発見のためのハミルトンスミスに与えられた。科学及び薬の制限の酵素の最初の実用的な使用は糖尿病患者のための組換えの人間の インシュリンを表現する E. 大腸菌の細菌の処理だった。

制限の酵素を扱い、使用する

制限の 酵素 作業の単位は1 時間の時間の完了にバクテリオファージlambda のDNA の1 マイクログラムを切るために必要なrestrition の酵素の量によって定義される。

酵素の製造業者によって開発される基板として非常に浄化されたDNA を使用して(すなわちプラスミッドかlambda のphage DNA) できている試金は本当らしく特定の準備との最もよい結果を生む試金は調節する。頻繁に実験室の状態は理想としてないし、完全な消化力の保障を助けるのに酵素またはより長い孵化ピリオドのわずかな超過分が使用されている。

色々な酵素を使うが、頻繁にあらゆる1 つの酵素のための最も有効な条件を満たさない多くの' 普遍的な' 酵素バッファがある。普遍的なバッファが有効ようにないので、私達は実験室の彼らの定期的な使用を推薦しない(特に複雑なgenomic DNAs のために; 複雑なgenomic DNAs のダイジェストは酵素を禁じる高いDNA の集中に通常ある; また、完全な消化力のより多くの単位の酵素のard のより長い孵化の時間を必要とする) 比較的粗野なDNA preps は抑制剤を含むかもしれない。restricition の消化力のために製造業者の推薦された試金の状態を使用するためにそれは常に最もよい。ある製造業者は同じ酵素の他のバージョンからの非常に異なった条件がある、従って前に点検するを使用してクローンとして作った酵素を。酵素の集中は常に酵素の管の側面で与えられる。実験室で使用される制限の酵素は常に-20 度C で(グリセロールベースで) 保存され、-20 度C に可能ように酵素の生命を拡張すること同様に近く保たれるべきである。ダイジェストをセットアップした場合、アイスペールの酵素のフリーザーに反作用の管を持って来なさい; 酵素を使っている間酵素の管をフリーザーから除去し、氷の管を保ちなさい。終えられた場合すぐフリーザーに管を戻しなさい。酵素を標準的な管から除去した場合pipetmen 、制限の酵素だけのために指定されて常に使用する新しいpipetman 先端を使用しなさい。

制限の酵素の使用法の先端

• 制限の酵素の製造業者全員は酵素を特定のバッファに供給し、これらは-20.C のフリーザーで保存されるべきである。制限の酵素はまた-20.C で保存されるべきである。
• 決して最終的なボリュームで多くにより1/10 年を構成する制限の酵素が付いている制限のダイジェストを編纂してはいけない。これは制限の酵素蛋白質がグリセロールで保存されるという事実のためにそうなったものである。10% の上の集中しか、グリセロールは消化力を禁じまた星の作業を引き起すことができ- DNA の異常な、無指定の切口に導く。
• 制限の酵素を使用した場合制御ダイジェストをセットアップしなさい。これは酵素がきちんと働いている反作用をよくセットすればかどうか知るのを助け。知られていた分裂パターンを生成するプラスミッドのDNA を使用しなさい。
• 二重酵素のダイジェストを準備した場合、バッファの塩分を定めなさい。より低い塩の条件の酵素を使用して制限の消化力を最初に行ない、そして第2 最適の塩の集中に反作用の管のバッファを合わせることによって第2 酵素を使用しなさい。
• DNA の準備に制限の酵素の消化力の作業を禁じることができる不純物があるかもしれない。あるDNA の分離キットは高いEDTA バッファをDNA を溶離するのに使用する。これはDNA の記憶のために良い、しかしEDTA の高い集中は制限の消化力を禁じることができる。PCR は酵素作業がDNA の一見良く禁じられればDNA を浄化し、TE と溶離するか、または水をまく。また反作用にかどうかそのヘルプまたMg2+ を追加し、見ることができる。
• 余分酵素を追加した後DNA の完全な制限の消化力を得ることができなかったら新しいダイジェストをセットアップし、2 ミリメートルの最終的な集中にspermidine を追加しなさい。

DNA の制限の酵素の消化力

Preparative 制限の酵素の消化力対分析的

通常DNA の消化力は25 - 50 のUL (マイクロリットル) でちょうどDNA を点検するか、または分析したいと思うとき、行なわれる。これらは分析的な制限の酵素の消化力と呼出される。

1 つは分析的な準備のための0.25 から2 ug (マイクログラム) を消化できる。これはagarose のminigel (30ml) で、1 つが1 バンドにつき05.ug (50 NG 、nanograms を) およそ視覚化できるのである。バンドの視覚化はDNA の長さおよびDNA の現在の量に左右される。大将では、より長いDNA バンドで現在の、より容易の見ることであるある。

50 からの多くのマイクログラムそして高いボリュムのDNA の消化力- 500 の UL (マイクロリットル) または多くはpreparative 、それに続く浄化のためにDNA のフラグメントを準備して、クローンとして作っていることを意味するであり。

DNA のプロトコルの制限の消化力

制限の 酵素の消化力のための調理法:

分析的

DNA の大きいボリュームを使用すれば消化力の反作用にMg2+ を追加するかもしれない(MgCl の形で) 。特にバッファ含まれていたEDTA のDNA を溶離したらこれをするべきである。これは"X" が大きければ、ie > 20ul ボリューム、EDTA のあらゆるモルのためのマグネシウムの4 モルにマグネシウムのEDTA の縛りを追加する必要がある場合もあるのである。従って、EDTA の1 ミリメートルの(milimolar) 解決のDNA はマグネシウムの4mM を結合する。よい目分量はDNA のあらゆる20ul に10mM MgCl の1 1ul を追加するべきである。

Preparative

1 - 3 時間37.C でIncubate 。

1 単位は1 時間のdigest1 ug のDNA へ十分な酵素少なくともである。3 時間消化DNA の高い量を消化できる。酵素の10-20 単位を追加しているので、1 時間のDNA の10ug を消化できる! 酵素は高い不必要に無駄にしないそれらを!

酵素の使用法のノート:

• 酵素を 冷たい保ちなさい。
• 常に氷の制限の 酵素を保ちなさい !
• あなたに氷の制限の酵素がある時間を最小にしなさい。によって購入容易にするあなたが酵素を保つ) 金属のブロック基本にであるこれを冷たいボックス(ことができる

参照:

Sambrook 、J. 、Fritsch 、E.F. およびt. Maniatis.(1989) の分子クローニング、実験室マニュアル。第2 版。冷たいばね港の実験室の出版物。PP 5.3- 5.32 。

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