Genomic DNAの隔離のプロトコル

Genomic DNAの浄化方法の選択

genomic DNAの隔離の目的は隔離の後のDNAのアプリケーション何によって決まる。 DNAの純度、ソース、量および品質はgenomic DNAの抽出前に扱われる必要があるすべての問題である。異った方法の全多く、技術およびキットはセルからのgenomic DNAを隔離して研究者に今使用できる。

量のDNAは必要とした
DNAの分子量そしてサイズ
DNAの純度は必要となった
DNAの下流アプリケーション
空き時間
DNAの抽出技術または方法の容易さ
使用できる費用かお金

自作または実験室特定のDNAの抽出方法は頻繁にかなりよくそれらを開発した実験室のために規則的にこれらのプロトコルを使用し。

しかしノートはこれらの方法標準化に欠けている。またDNAの収穫およびDNAの品質は1人から次に再生可能常にではない。

Genomic DNAの隔離および浄化の背景

通常、すべての方法はセルの中断そして換散を含む。これはRNAの取り外しに時々先行している(RNAses、塩または他の方法によって)。どの方法使用することはを含む多くの選択の要因によって決まるか選択する:

DNAは酵素のプロティナーゼK.蛋白質で蛋白質の消化力を含む複数の方法で蛋白質からDNAの塩析、有機性抽出、または不良部分によって続いて除去されるsolid-phaseサポートに隔離される(anion-exchangeのコラムまたは無水ケイ酸の技術のような)。

DNAはエタノールの沈殿物かイソプロパノールの沈殿物によって最終的に回復。

一般に、セルからのDNAの分離および細胞コンポーネントは4つの段階に分けることができる:

セル中断
セルの換散
蛋白質および汚染物の取り外し
DNAの回復

あるgenomic DNAの隔離のプロトコルでは、段階1および2は結合される。

材料はGenomic DNAの抽出方法のために必要とした

Genomic DNAの調理法のための換散バッファ:

50のmM TrisHCl、pH 8.0
50mMのEDTA
1% SDS
10mM NaCl

組織サンプルからのGenomic DNAの浄化方法

使用するために組織サンプルを選びなさい。サンプルが氷できちんと準備され、保たれることを確かめなさい。サンプルがDNAの抽出のためにすぐに使用されなければ、サンプルはより長期的のための-20°Cのフリーザーか短期(数時間の)使用法のための4°Cできちんと保存されなければならない。
より小さい部分への切口のティッシュ。レバーか他の柔らかいティッシュのために、良い部分の作成を心配してはいけない。
ティッシュを事前に冷された(ドライアイス)乳鉢に追加しなさい、すぐに液体窒素のN2を追加しなさい。
良い粉にティッシュをひき始めなさい。より多くのLiqを追加しなさい。必要とされるN2。 30のmlの管、そう許可によってへの転送の冷たい粉はふたを取られるN2蒸発できる。
每暖められるの9つのmlを追加しなさい(5°C)換散バッファは穏やかに粉を再停止し。
プロティナーゼKの10mg/mlの100 ulを追加しなさい、(解決のすなわち、100 ug)。 55°Cを1-18時間孵化させなさい。定期的に穏やかに混合しなさい。最初2時間後にプロティナーゼK、最適の100 ulを追加しなさい: 1.5時間にプロティナーゼKを追加する3時間。
御馳走サンプル非常に穏やかに。 3M Na0Ac (pH 4.0)の1つのmlを、暖かいの10のml追加しなさい(55°C)フェノールは5-10分の間、穏やか完全に混合する。
15分のためのサンプルを遠心分離機にかけなさい。
暖かいフェノールの抽出を繰り返しなさい。
等しいボリューム(10ml)フェノールが付いているエキス: CIA (1部のフェノール: 1部CIA: CIA= 23はクロロホルムを分ける: isoamylアルコール1部の)
等しいボリューム(10ml) CIA抽出が付いているエキス
上部段階は大きく白い強打を含んでいれば、比較的明確なべきまたは非常に乳白色である、(i)は15 min. 68°C、および再フェノールのエキスで、(ii)開始再度孵化するが、P-Kとより長く孵化する。
新しい管への転送の上部段階。冷たいエタノールの2つのボリュームを追加し、穏やかに混合しなさい(塩: Na0Acは解決に既にある)。ホックおよび密封されたpasteurを使用してスプールDNAをピペットで移しなさい。管の側面の余分なエタノールをふき取りなさい。 TEの2-5のmlsで再停止しなさい。 DNAが完全に分解することを確かめなさい(穏やかなシェーカーの許可。)
RNaseの組合せ(RNaseT1のRNase A、10Uの100 ug)を追加しなさい。 30最小37°C.を孵化させなさい**プロティナーゼKの前にRNaseを追加でき、1時間37°Cで孵化し、そして次にプロティナーゼの消化力を開始する。それからステップ15-をとばすことができる。
プロティナーゼKのincubae 37°Cの100 ugを30分追加しなさい。
1/10のVol. 3M Na0Acのフェノールのエキスを、フェノール一度追加しなさい: 二度CIAのエキス、一度CIAのエキス。
EtOHの2.5ボリュームを追加しなさい、-20°Cに30 min.の遠心分離機を20 min.置きなさい。
70%とよく洗浄しなさい、すべてのEtOHを除去しなさい。乾燥したら、乾燥したに。
、ゆっくりin1-2mls TE (TrisEDTAバッファ)注意深く再停止しなさい。 (1xか0.1x)。