試金のDNA 蛋白質の相互作用

DNA 蛋白質の相互作用を試金する方法について学びなさい。

DNAProtein の試金の相互作用

DNA 蛋白質の相互作用を試金する為の4 つの重要な技術がある。最初の2 つの技術は(フィルター結合及びゲルの移動性シフト) 定めるDNA が蛋白質と相互に作用しているかどうか。蛋白質とDNA 間の相互作用のターゲットサイトがDNA にあるどこに他の2 つの技術(DNase Footprinting 及びDMS Footprinting) は示す。

フィルター結合

解決をfilter-sterilize ために硝酸セルロースの薄膜フィルタは一般的である。硝酸セルロースフィルターはある条件の下でDNA を、しか結合できない。Singlestranded のDNA は硝酸セルロースに容易に結合するが、それ自身による倍によって座礁させるDNA は。一方では蛋白質は結合し、蛋白質がdouble-stranded DNA に区切られれば蛋白質DNA の複合体は結合する。より多くの情報に関して硝酸セルロースフィルター結合の試金の記事を参照しなさい。

移動性シフトをゼリー状になりなさい

DNA 蛋白質の相互作用を測定するためにはこの技術は小さいDNA にゲルの電気泳動で大いにより高い移動性があるという純然たる事実に蛋白質に区切るべきであると同じDNA がより頼る。従って私達はソート倍によって座礁させるDNA のフラグメントを分類できたりそして蛋白質とそれを、及びelectrophorese 複合体混合する。分類された種を検出するためにそれから私達は放射線写真法のゲルを服従させる。DNA の小さいサイズはこの試金で重要である。全遺伝子が使用されたら移動性は既に非常に低く、蛋白質の結合によって引き起こされた移動性シフトは検出しにくい。従って私達は短い制限のフラグメントを準備できるかどこで総合的なdouble-stranded オリゴヌクレオチドを少し他におよそ蛋白質がDNA に従って私達が結合するまたは蛋白質のためのターゲットサイトを含んでいる、ならない知らなければ。

DNase Footprinting

蛋白質はある特定のDNA に結合することを私達が知っていれば私達はターゲットサイトがDNA にあるどこに見つけるfootprinting を使用できる。footprinting Dnase はDNA ことをへの不良部分による蛋白質が結合サイトを覆う頼り、従って攻撃からDnase によってそれを保護するという事実に。この感覚でそれはDNA に"足跡" を残す。footprinting 実験の第一歩は終り分類するDNA をある。私達は1 実験につきどちらかの繊維、1 だけを分類できる。次に、私達はDNA に蛋白質を結合する。それから私達は穏やかな条件(少しだけDnase) の下でDnase I と切られるDNA の1 分子につき1 だけの平均が行われるように、DNA 蛋白質の複合体を扱う。次に、私達はDNA から蛋白質を、分けるDNA の繊維を取除き、electrophorese 高リゾリューションのpolyacylamide の生じるフラグメントはサイズのマーカーの横でゼリー状になる。フラグメントもまたDNA の他の端から起こるが、無標号であるので私達はそれらを検出しない。私達は常にだけDNA との制御を(蛋白質無し) 含み、通常1 つ以上の蛋白質の集中を使用する従ってDNA の保護が追加された蛋白質の集中に左右されることを私達は足跡領域のバンドの漸進的な消失によって見ることができる。従って足跡は蛋白質が結合するどこで蛋白質によって保護されるDNA の領域を表し私達に告げる。

DMS Footprinting

footprinting Dnase は蛋白質のための結合サイトの位置のよい考えを与えるが、従ってDnase は高分子、結合サイトの良い細部を厳密に調べる為の幾分鈍い器械である。意味するかどれが、そこにそれは蛋白質間の相互作用のギャップであるかもしれ、Dnase が合わなかったし、従って検出しないDNA は。さらに、DNA の結合蛋白質は頻繁に二重螺旋形を歪める結合領域内のDNA を混乱させる。これらの摂動は蛋白質がDnase を離れた保つので興味深いが、footprinting Dnase によって一般に検出されない。より詳しいfootprinting をすることを、私達は複雑なDNA 蛋白質の隅そして隙間に合うことができる必要とし、相互作用のsubtleties の多くを明らかにするより小さい分子が。このジョブのための好みのツールはメチル化のエージェントのdimethylsulfate (DMS) である。

footprinting DMS から私達はと同様にDNA および結合の終り分類によって、footprinting Dnase で蛋白質開始する。それから私達は平均で1 メチル化しかDNA の1 分子につき行われないように穏やかな処置を使用してDMS が付いているDNA 蛋白質の複合体を、メチル化する。次に、私達は蛋白質をずらし、メチル化されたプリンを取除くDNA のapurinic サイト(ベースのないdeoxyriboses) を作成する試薬とDNA を扱う。それから私達はこれらのapurinic サイトでDNA を壊す。これらの反作用は反作用を配列するMaxam-Gilbert のDNA と同じである。electrophorese 最終的に私達はDNA のフラグメントおよびautoradiograph 分類されたDNA を検出するゲルバンドが付く。各バンドは蛋白質によってこうして無防備メチル化されたヌクレオチドの隣で終了し。

3 次元の DNA の分子を見なさい

DNA はプロトコルを作成する