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DNA Footprinting

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DNA Footprinting の背景

footprinting DNase は特性の開発によってDNA と相互に作用している蛋白質は制限の消化力かDNAase の酵素の開裂からその相互作用のサイトでDNA を保護することDNA 蛋白質の相互作用の検出を可能にする分子生物学方法である。特定の結合サイトを含んでいるDNA の制限のフラグメントは32P の1 つの端に、通常分類され、footprinting のために使用される。

蛋白質が及びDNA は一緒に交配させ、結合する。

蛋白質にバインドされたDNA を保護されて去るradiolabeled ( または分類される)DNA を消化するか、または 自由に切るためにfootprinting DNA は酵素のDNase I かd のeoxyribo n のucleic 酸のnucle のase I を利用する。DNA の制限のフラグメントはDNA の単一繊維の壊れ目(刻み目) を作るDNase I と軽く扱われる。少しの酵素はより少しにより1 nick/strand の平均があることそのような物使用される。反作用はそれから停止する、DNA は変化し、混合物はゲルを配列する変化の�&リアクリルアミドでランされる。保護されたDNA 領域を検出するためにゲルの電気泳動によって分かれているこれらのフラグメントはゲルのバンディングの開裂パターンの分析によって露出される。

普通自由なDNA と言われるDNA 結合蛋白質がない時のDNA の開裂パターンは、DNA 結合蛋白質の前でDNA の開裂パターンと比較される。蛋白質がDNA を結合すれば、結合サイトは酵素の開裂から保護される。この保護は"足跡" と言われるゲルのクリア・エリアで起因する。

DNA 結合蛋白質の集中の変化によって、蛋白質の結合親和性は足跡が観察される蛋白質の最低の集中に従って推定することができる。

DNAse のFootprinting バッファ調理法

DNase のFootprinting 結合バッファ調理法

KCl なしの/10mls のための2X:

量: [ 最終]
Tris-HCl pH7.6: 1M の500 のUL: 50 ミリメートル
MgCl2: 1M の125.ul: 12.5mM
EDTA: 0.5M の2 つのUL: 1mM
グリセロール: 2 つのmls: 20%
DTT: 1M の10 のUL: 1 ミリメートル

結合バッファ(ゲルシフトバッファ)

KCL なしの5X
[ 最終]: 原料
20%: gylerol
5mM: MgCl2
2.5mM: EDTA
2.5mM: DTT
250mM: NaCl
50mM: Tris-HCL 、pH 7.5
0.25mg/ml: 多(ディディミアムdC) 多(ディディミアムdC)

Ca/Mg バッファ

10mls のため
CaCl2: 1M の50 のUL: 5 ミリメートル
MgCl2: 1M の100 つのUL: 10 ミリメートル

ローディングの解決
0.1 M: NaOH:formamid (1:2 v/v)
0.1%: キシレンのcyanol
0.1%: ブロモフェノールの青

停止バッファ
10mls
NaCl: 5M の400 のUL: 200 ミリメートル
EDTA: 0.5M の600 のUL: 30 ミリメートル
SDS: 1 ML 10%: 1%

TEBe (Tris EDTA ベータmercap 。)
Tris-HCl 、pH 7.6: 1 つのM の500 のUL: 50 ミリメートル
EDTA: 0.5 のM の2.ul: 1 ミリメートル
ベータbeta-mercaptoethanol: 10 のUL: 15mM

10 のx K バッファ
1 ML のため
Tris-HCl pH 7.5: 1 つのM の100 つのUL: 100 ミリメートル
MgCl2: 1 つのM の100 つのUL: 100mM
DTT: 1M の50 のUL: 50 ミリメートル
dH2.O: 750 のUL

DNAse のFootprinting のプロトコル

使用されるDNA は通常興味の蛋白質の結合サイトを含んでいる。DNA は制限のフラグメントとappopriate のサイズであるために浄化されたり、そして消化される。DNA のフラグメントは1 つの端(結合サイト> 端からの25 bp) で分類される。

1 基の繊維の分類はaccomplised ある場合もある:

1. 5' 突出部分を含んでいる制限のenzyme(s) が付いているフラグメントの隔離Klenow 及び適切で熱いヌクレオチドと分類する。そして1 つの端を除去する酵素が付いているダイジェスト。
2. 5' 及び3' 端を作成するKlenow と分類する制限の酵素と消化されたフラグメントを隔離することは5' 突出部分しか分類しない。
3. を用いる"a でように" しかし酵素および第2 (第3) 制限の酵素が付いている端の1 つを離れて3' 端(キナーゼ) を使用することそして消化分類するのにpolynucleotide のキナーゼを。
   (メモ: 、反作用の終わりにKlenow と分類していたら確かめるために(すなわちdCTP32 を使用したら、端にdCTP を追加しなさい) すべての端均等に記入される分類される同じヌクレオチドの冷たいヌクレオチドの超過分を追加しなさい。

Klenow のフラグメントのために、0.3.ug はTE の100 つまでのUL 、10 分の68 .C の熱の殺害Klenow を持って来る。

1 5' 突出部分との分類

サンプルRXN: 15 NG は各反作用のための必要性である。多くの反作用のDNA の公正な増加量のためのプローブを300 のngs まで作っていたら。
15ng: DNA のフラグメント
2 つのUL: 10x K バッファ
5 つのUL: 32P dCTP 3.33 UM 10 uCi/ul
2 つのUL: 2mM の@ dA 、dG のdTTP
1 つのUL: Klenow
20 のUL の最終的なボリューム、37.C 30 分。
-- 1 つのUL 10mM のdNTP 、5 分@ 37.C を追加しなさい。

-- 80 のUL TE を追加しなさい。68.C は15 分、氷を置いた。
-- G-50 回転のコラム(約2000g の回転)
-- EtOH 1/10 のVol. 3M を、凍らす30 分を、([ DNA ] = または> 3 ng/ul があったら任意選択G-50 を直接掲示するかもしれない) Microfuge 30 分追加しなさいNa0Ac 、2.5 ボリュームの。
-- 70% と洗浄しなさい
-- 乾燥した5.ul を持って来なさい

DNase Footprinting のための結合の反作用

結合の反作用は10 及び150mM のKCl の間で持つべきである(より多くの塩は結合することを増加の特定性減る) 。典型的な集中は50mM である。

蛋白質のDNA の結合:
KCl なしの2X 結合バッファの25 のUL
3 ng/ul の5.ul はDNA をunilabeled
KCl 10-150 ミリメートルに匹敵するKCl のX UL
結合のためのボリューム引く同輩50 のUL へのdH20 はprotien
1-3 DNA の結合蛋白質のFootprinting の単位(または粗野な核エキスの10 から160 ug)

-- 、凍らす10 分を穏やかに混合しなさい。

タイミングに留意しなさい、
-- RT Ca/Mg の解決、1 分の18.C の50 のUL を追加しなさい。
-- dilute RQ1 DNase (Tris で薄くなる0.05 u/ul) が1 分をINCUBATE 3 つのUL を追加しなさい。
-- 37.C 停止解決との90 の付加を停止しなさい、

-- フェノールがもし: CIA およびCIA のエキスおよびエタノールの沈殿物。
-- ローディングの解決の4.ul でresuspend 。
-- DNA の梯子、切られていないDNA 、および制御のようなappopriate のローディングの車線が付いているゲルを(くさびのゲルを考慮しなさい) 配列する5% の標準尿素DNA でランしなさい。

footprinting パターンを分析しなさい。

トラブルシューテ-ィング及び問題か。DNAse のFootprinting のフォーラムを見なさい!

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