DNA のクローニング

DNA のクローニングについて学びなさい。

DNA のクローニング

(complemantary DNA かコピーのDNA のために短い) DNA はRNA 、通常mRNA のDNA のコピーである。時々私達はDNA ライブラリ、一組のある特定の時にある特定のセルタイプのmRNAs のできるだけ多くreprensenting クローンを作りたいと思う。そのようなライブラリは数万の異なったクローンを含むことができる。他の時間、私達はちょうど1 のmRNA のDNA のコピーを含んでいる1 特定のDNA のaclone を作りたいと思う。私達が使用するこの技術はこれらの目的の私達が達成したい一部には左右される。

DNA ライブラリ

DNA ライブラリを構築したいと思えば私達はプロセス呼出された刻み目変換に頼る簡単で有効な作戦を使用できるが。刻み目変換の本質は刻み目の後ろの刻み目(単一座礁させたDNA の壊れ目) およびDNA の統合に先んじるDNA の同時取り外しである。最終結果は移動するべきであるまたは5'-3 の刻み目を' 方向変換しなさい。私達が通常刻み目変換を使用する酵素は5'-3 が' 移動すると同時に酵素が刻み目に先んじるDNA を低下させるようにするexonuclease の作業あるE.coli のDNA の�&リメラーゼI である。

中央部分はあらゆるDNA のクローニングプロシージャ逆のtranscriptase を使用してmRNA のテンプレートからのDNA の統合である。逆のtranscriptase は他のどのDNA 総合の酵素のようもプライマーのないDNA の統合を始めることができないことであるである。この問題のまわりで得るためには、私達はほとんどのeukaryotic mRNAs の3' 終りにpoly(A) の尾を利用し、プライマーとしてoligo(dT) を使用する。oligo(dT) はpoly(A) に補足である、従ってmRNA の3' 終りにpoly(A) に結合し、テンプレートとしてmRNA を使用してDNA の統合を、発動を促す。

mRNA がコピーされた後、単一座礁させたDNA ("最初繊維" もたらす) を、私達は部分的にリボヌクレアーゼH (h) とのRNase mRNA を低下させる。この酵素はちょうど私達は私達の最初繊維のDNA からのRNA を消化し始めることを必要とするか何がRNA/DNA のハイブリッドのRNA の繊維を低下させる。残りのRNA のフラグメントはテンプレートとして第1 を使用して"第2 繊維を、" 作る為のプライマーとして役立つ。これはプロセスの刻み目変換段階であり、再度、E. 大腸菌のDNA の�&リメラーゼI は私達が刻み目変換の反作用を遂行するのに使用する酵素である。最終結果は第2 繊維の5' 終りにRNA の小さいフラグメントが付いているdouble-stranded DNA である。
私達の次のタスクはベクトルへDNA をligate である。これは制限の酵素と裂かれたgenomic DNA の私達の部分と容易だったがDNAS に粘着性がある端がない。私達はそれが比較的非能率的なプロセスであるのに鈍い端を一緒にligate できる。但し、粘着性がある端による有効なligation がほしいと思えば私達はターミナルdeoxynucleotidyl のトランスフェラーゼ(TdT) またはdeoxribonucleoside の三リン酸塩の単にターミナルトランスフェラーゼおよび1 つと呼出される酵素を使用してDNA に粘着性がある端(oligo[dC ]) 、留めることができる。ケースでは、私達はdCTP を使用する。酵素はDNA の3' 終りに一つずつdCMPs を追加する。同じように、私達は私達のベクトルにoligo(dG) の端を接続し、oligo (oligo(dG)s にアニールするべきdC)s を許可する。これは変形のために直接使用することができる組換えのDNA でベクトルおよびDNA を一緒に持って来る。オリゴヌクレオチドの尾の間で基礎に組み合わせることはligation が変形の前に必要とならないこと十分に強い。変形させたセルの中のDNA のリガーゼは最終的にligation を行う。

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