DNA のクローニング

DNA のクローニングフォーラムのトピック

糸
糸タイトル/�&スター	最後の�&スト	応答	眺め
南極ホスファターゼのDNA のクローニング dnamolecule	03-24-2008 02:03 PM JO18 著 "	1	353
青く白いクローニング選択の陽性のコロニー liono	02-20-2008 08:45 AM Priyanka 著 "	1	588
鈍い端のクローニングDNA pipette_man	01-23-2008 04:17 AM postdock によって "	2	450
クローニングDNA biojoe	05-16-2007 06:30 PM biojoe によって "	0	896
クローニングDNA biojoe	12-31-1969 11:00 PM によって "	0	82
PCR からのクローニング pipette_man	03-28-2008 10:58 AM serenacorallini によって "	3	505
クローニングベクトル aftabac	07-19-2007 04:53 AM aftabac によって "	0	534
私はクローニングについての何でも!! 知っているだれでもまたは医者捜している! Rocky89	06-04-2008 12:46 AM Rocky89 著 "	5	92
必要性のhelp!!molecular クローニング bsengez	11-12-2007 07:44 PM bsengez によって "	4	553
ベクトル有能なセルをクローンとして作っているコロニー無し princezz	01-24-2008 03:27 PM princezz によって "	2	253
PCR "クローニング" これは可能であるか。 Ammie	09-17-2007 04:16 PM danfive によって "	1	302
PCR 及びTopo のクローニング kiki06	12-05-2006 09:49 PM kiki06 によって "	2	1283 年
cloning/restriction のダイジェストとの問題 shurgood	01-24-2008 10:15 PM shurgood によって "	0	368

DNA のクローニングフォーラムの質問を今掲示しなさい! ここにクリックによってヘルプを得なさい

プラスミッドへのクローンとして作る挿入

DNA のクローニングプロトコル

クローンとして作ることを次が必要としなさい:

DNA かプラスミッドの構造物を方向を変えなさい

ベクトルDNA は次のとおりである場合もある:
(ある必要があるベクトルまたはプラスミッドのDNA

クローンとして作ることをベクトルDNA の少なくとも複数のマイクログラムが(3-5 または多く) 必要としなさい。

DNA ( あなたがプラスミッドかベクトルに挿入したいと思う) をDNA 挿入しなさい

挿入DNA は次のとおりである場合もある:
オリゴヌクレオチドの挿入(制限のoligos はPNK とアニールされ、phosphorylated 半分サイトを切った)
制限の酵素は挿入を生成した
PCR の挿入(制限の酵素とのPCR はサイトを切った(全サイトは必要! である) プライマーの’ 5 端)

あなたがクローンとして作りたいと思う挿入がより少しよりなら60 bp のオリゴヌクレオチドを発注し、一緒にアニールすることができる。

挿入DNA のサイズが小さければ(より少しにより1000 年のbp) 、ベクトル論理上同様に多くのDNA を必要としない。挿入DNA のサイズが極小(10-200 bp) なら、このDNA の少しだけ論理上必要とする。

一般に挿入DNA の開始の少なくとも1 マイクログラムを有するべきである。

クローニングのためにベクトルDNA を準備すること: 小型prep 、ミディprep 、マキシprep

私達はDNA を準備する最も容易な方法が小型prep キット使用していることが分った(Qiagen) を。私達は同じベクトルDNA の構造物のために複数のコラムを使用する。

各コラムのために私達は約4 ML の�&ンドによって育てられる細菌(私達は2 ML のeppendorf の管に2 ML の�&ンドの細菌の流体�&養基を追加し、= 2 つX 2 つをML = 4 ML 二度回す) を追加する

先端: グリセロールの細菌が80 C のフリーザーの凍結するに貯蔵するように常に約5 ML の15 ML の隼の管の�&ンドを、保つ – 1 ML を育てなさい。

グリセロールに(幾年もの間保つ – 80 C のフリーザーのための細菌の在庫をする方法決して版を縞にするか、または有能なセルを再度作る必要がない! – 時間保存する)

細菌の成長�&ンドに50% のグリセロールを単に追加しなさい。これは約1 ML の細菌の�&ンドを追加し、100% 年のグリセロールの約500 のUL を80 C でフリーズすれば残されれば厳密なie – であるならない。

EB の約50 のUL の各コラムを溶離した後(溶出バッファ、Qiagen のTris バッファは – EDTA を含んでいない) 、私達は私達におよそ200 のUL から400 のUL あること溶出液をそのような物分かち合う(または構造物 – または1 ベクトルにつき4 つの8 つのコラムが) 。これは与えるクローニングのための十分な開始のベクトルDNA をある。

注: 私達はTE のEDTA が小型prep 及び他のプラスミッドの浄化キットから溶離されたDNA のそれに続く制限の消化力を禁じることが分った。

クローニングのために挿入DNA を準備すること

挿入DNA はあるなる

制限の酵素の消化力及び切断DNA のクローニングのためのプラスミッドのベクトル

プラスミッドのベクトルは通常切られる。

挿入及びベクトルのLigation

挿入を方向を変えるためにLigate ようにガイドとしてベクトルの200 NG を使用しなさい(人々は50 NG N.E.B マニュアル同様に – 少しを使用する) 。

NG = ベクトル NG 挿入しなさい
サイズのベクトルサイズを挿入しなさい

従ってあなたが必要とする5000 のbp のベクトルに500 のbp の挿入をligate ため

挿入NG = 200 NG X 500
5000

挿入は 1 のためにNG = 挿入の20 NG 必要とした: 1 つのligation

挿入3 のため: あなたが必要とする1 つのベクトルligation: 60 NG

Ligation

X UL の    DNA のベクトル200 NG
Y のUL の     挿入(計算されたNG)
2 UL 10 X バッファ
1 つのUL T4 のDNA のリガーゼNEB
20 のUL H20     に

20 のUL は   合計する

Ligation の5 つのUL を取り、DH 5 のアルファのセルInvitrogen の100 つのUL に追加しなさい
(Subcloning の効率の承諾、1 撃たれたよりよい、最大効率最もよく – 堅いligations のためにしかし高い) 。

衝撃を熱しなさい
有能なセルにSOC の250 のUL を追加しなさい

版の全体の量をめっきしなさい。

37 C でovernite を育てなさい

友人にこのページを送りなさい

指定しなさい: ベクトルサイズ: bp
指定しなさい: 挿入サイズ: bp
比率: (ベクトルDNA の1 モル毎の挿入DNA のモル)

のためベクトルDNA のNG は、追加する挿入DNA のNG 。

Bioinformatics のプロトコル、DNA のRNA 蛋白質Proteomics

細胞内端末