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Mycoplasma の汚染 & 細胞�&養

私達はmycoplasma の汚染の細胞�&養の実験室、情報およびすべての汚染の質問および議論の最も最近のmycoplasma のフォーラムの議論のためにここに含んでいる。

Mycoplasma の背景

Mycoplasmas はセル壁に欠けている細菌の属である。セル壁の欠乏のために、それらはペニシリンを含む多くの抗生物質か標的細胞の壁の統合他のベータラクタムの抗生物質に対して抵抗力がある。

Mycoplasma は寄生またはsaprophytic である。複数非定型肺炎および他の呼吸器疾患の重要な原因である、および骨盤の炎症性病気にかかわると信じられるM. のgenitalium 病気引き起しているMycoplasma は人間で、M. のpneumoniae を含んで。それらによりある癌に引き起こすか、または貢献するかもしれない。

属Mycoplasma

属Mycoplasma はクラスMollicutes 内の複数の属の1 つである。Mollicutes は小さいゲノムがあり、セル壁に欠け、そして低いGC 内容(18-40 %) が。ある細菌である

属Mycoplasma の100 つの確認された種にある。ゲノムのサイズは0.58 の1.38 のmegabase ペアから及ぶ。Mollicutes は人間、動物(を含む昆虫) 、およびプラントの寄生虫または共動生物である; 属Mycoplasma はvertebrate ホストに制限される定義によって行う。コレステロールはmollicutes のある他の属と同様、属Mycoplasma の種の成長に必要となる。最適成長の温度はホストが自身の内部温度を調整してなければ(例えば37 の程度摂氏人間で) または包囲された温度warmbodied ホストの温度頻繁にである。16S 遺伝子の内容、またribosomal RNA シーケンスの分析は強くmollicutes が、mycoplasmas を含んで系統発生の木(Firmicutes のsensu のstricto) の乳酸桿菌かクロストリジウムの枝と、密接に関連している提案する。

セルライン及びMycoplasmas

細胞�&養では、mycoplasmas は細胞変更、染色体のaborations を含んで、新陳代謝の変更およびセル成長を誘導するかもしれない。厳しいmycoplasma の伝染はセルラインを破壊するか、または無用高くか貴重なセルラインをするかもしれない。

Mycoplasma との細胞�&養の汚染

Mycoplasmas は頻繁に研究所にように細胞�&養の汚染物ある。Mycoplasmal 細胞�&養の汚染は個人か汚染された細胞�&養媒体の原料から汚染のために行われる。

Mycoplasma の検出方法

従ってMycoplasma のセルは1 つの.m より小さく、慣習的な顕微鏡検査方法と検出し通常かなりにくい。検出の技術は下記のものを含んでいる:

• PCR
• 実時間PCR
• 敏感な寒天のめっき
• DNA はDAPI またはかHoescht の汚れの含を汚す

Hoechst の汚れのMycoplasma の汚染の検出のプロトコル

Mycoplasma のための方法を汚すHoechst (シグマ、カタログ#:H6024):

1. 付着性のセルのために、ペトリ皿に生殖不能の保護ガラスを置きなさい。coverglass の真中でセル中断の2-3 低下を追加しなさい(セルの成長率によって) 。
2. それから注意深く2-3 ML のセルを妨げないで媒体を追加しなさい。合流する50 -70% であるまでセルを育てなさい。

固定のセル:

1. 組合せのfo 3:1 のメタノールであるセル定着剤を準備しなさい: 氷�&酸(M:AA) 。使用の前に新しいこれを準備するために確かめる。
2. 成長のセルからの不用物媒体。2 ML のメタノールを追加しなさい: 版の側面にdropwise 氷�&酸M:AA の解決(直接セルに) 。版は渦巻き、解決を廃棄する。
3. 2 ML のM:AA を追加し、室温で2-3 分の間渦巻き、そして去りなさい。
4. 不用物M: 水が付いているAA の解決そして洗浄
5. 汚れて準備ができているまで乾燥した(版を保つことができる) Hoecht の汚れ(猫# シグマからの33258) の標準的な集中を乾燥する許可= あなたが0.2.uM を使用してこの段階で殺菌するフィルタに�&けることができる水の0.1 mg/ml 4 つのoC の使用液のアルミホイルの記憶装置のフィルター覆いの容器が必要として水の在庫の新しいいつも作る1:1000 の希薄(0.1 .g/ml) を準備する

セルの汚損:

1. 全体のカバースリップ(小さいペトリ皿のための使用1-2ml) をカバーするためにHoechst の十分な汚れを追加しなさい。
2. 45 分- 1 時間のための汚れを残しなさい(暗闇で) 。
3. 水でよく洗いなさい。
4. 顕微鏡のスライド(mountant 組合せに取付けなさい: クエン酸22 ミリメートルの; disodium 隣酸塩55.6 ミリメートルの; 5.5) カバースリップ(セル) 及びスライドの場所カバースリップ(セル) の場所への50% のグリセロール、pH の組合せ低下または2 。
5. けい光顕微鏡の下で視覚化しなさい

注: 少なくとも4.oC の記憶装置のHoechst の汚れ、か長期保管のためのフリーザーへの因数。