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原形質体の隔離のプロトコル



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原形質体の隔離のプロトコル

原形質体

変形を伴って有能な原形質体の準備

 

Saji MenonおよびVibha Tyagi
科学研究、彫像の円、ジャイプル(Rajasthan)のBirlaの協会、インド

 

原形質体の隔離に必要な材料

  • 70%のエタノール
  • 0.1%第二水銀塩化物
  • 0.5Mのマンニット

 

  • 酵素の解決:
  • 1%のセルラーゼ0.25% Macerozyme R-10
  • 27.2 mg/l KH2PO4
  • 101のmg/l KNO3
  • 1480のmg/l CaCl2.2H2O
  • 246のmg/l MgSO4.7H2O
  • 0.5Mのマンニット(pH 5.6)

 

  • セル原形質体の洗浄媒体:
  • 0.5Mのマンニット(pH 5.6)
  • 27.2 mg/l KH2PO4
  • 101のmg/l KNO3
  • 1480のmg/l CaCl2.2H2O
  • 246のmg/l MgSO4.7H2O
  • 修正された原形質体の培養基       

(表は次リストされている)

 

変形を伴って有能な原形質体の準備のためのプロトコル

  • 4-5の1週間目の無性状態で成長するプラントからの新しい葉を取りなさい。
  • 表面は1分の0.1%第二水銀塩化物との処理に先行している70%のエタノールで殺菌する。
  • 生殖不能の蒸留水と葉を完全に洗浄しなさい。
  • 葉のティッシュのより低い表皮の皮をむき、petriplateの1時間0.5Mのマンニットの解決に置きなさい。
  • マンニットの解決を除去し、ろ過殺菌された酵素の解決と取り替えなさい。
  • 25oCで16-20時間暗闇の版を孵化させなさい。
  • 0.45µMのナイロン膜を使用してろ過で原形質体の層を分けなさい。
  • 4時oCで10分の1000gで濾液を遠心分離機にかけなさい。
  • 上澄みを除去し、セル原形質体の洗浄媒体の餌を再停止しなさい。
  • 10分の1000gの遠心分離機。
  • ステップ9を二度繰り返しなさい。
  • 最後に修正された原形質体の培養基で1*105 ml/lの密度で原形質体の餌を中断しなさい。
  • petriplatesの薄層として原形質体をうまくめっきしなさい。
  • 暗闇の25 oCで版を孵化させなさい。

 

修正された原形質体の培養基

S.No.

要素

量

A

ミネラル塩

 

1

硫酸アンモニウム

82.5 gm/l

2

カリウム硝酸塩

95.0 gm/l

3

ホウ素酸

1190のmg/l

4

カリウムのDihydrogen隣酸塩

34のmg/l

5

ヨウ化カリウム

166のmg/l

6

ナトリウムのモリブデン酸塩

250のmg/l

7

コバルトの塩化物の二水化物

25.0 mg/l

8

カルシウム塩化物の二水化物

88.0 gm/l

9

マグネシウム硫酸塩のHeptahydrate

74.0 gm/l

10

マンガンの硫酸塩の四水化物

4460のmg/l

11

亜鉛硫酸塩のHeptahydrate

1720のmg/l

12

銅硫酸塩のPentahydrate

25.0 mg/l

13

エチレンのDiamino Tetra酢酸のDisodium塩

7.45 gm/l

14

鉄硫酸塩のheptahydrate

5.57 gm/l

B

砂糖

 

1

ブドウ糖

30.0 gm/l

2

リボース

0.5 gm/l

3

マンノース

0.5 gm/l

4

ソルビトール

0.5 gm/l

C

有機酸

 

1

ナトリウムのピルボン酸塩

5.0 mg/l

2

クエン酸

10.0 mg/l

3

リンゴ酸

10.0 mg/l

D

ビタミン

 

1

チアミンの塩酸塩

100つのmg/l

2

ニコチン酸アミド

500のmg/l

3

ピリドキシンの塩酸塩

500のmg/l

4

カルシウムpantothenate

250のmg/l

5

ビオチン

100つのmg/l

6

アスコルビン酸

75.0 mg/l

7

リボフラビン

50.0 mg/l

8

イノシトール

100 gm/l

E

ホルモン

 

1

2,4Dichloroフェノキシ酢酸(2,4-D)

0.5 mg/l

2

Benzylアミノのプリン(BAP)

1.0 mg/l