後援しなさい/広告しなさい & 私達にリンクしなさい & 私達に連絡しなさい & 私達について & 私達を助けなさい

分子生物学Blog

最近のフォーラムの�&スト

 

Polyclonal の抗体

完全にpolyclonal の抗体について。

Polyclonal の抗体は外部リソース- プロトコル…を関連付けた:

• 西部のしみ
• Immunoblot
• Immunoprecipitation (IP)
• ペプチッドを使用して抗体の作成

Polyclonal の抗体 の 多くのためのまた訪問の抗体端末。抗体およびプロトコルについて抗体の製造者をリストするのは新しいサイト、学ぶである。

Polyclonal の抗体はプロトコルを作成する:

• Immunizing マウス
• 血からの血清の準備
• ウサギの免疫
• ウサギの出血プロシージャ
• 血清の取得
• 血清からのIgG のアンモニウムの硫酸塩の沈殿物
• 免疫
• Polyclonal の抗体のスクリーニングのためのELISA のプロトコル

Polyclonal の抗体

 

Polyclonal の抗体は 血血清で見つけられる抗体の混合物と同じような多くのB セルかB セルラインから得られる抗体である。

従ってPolyclonal の抗体は多くの異なった抗体の特定性の混合物である。

購入されるPolyclonal の抗体の準備は同じ抗原へ多くの異なった特定性の抗体の混合物である。

ウサギ、マウス、ヤギ、鶏、または他の動物の免疫はpolyclonal の抗体を作り出す。動物の血清は実験室の使用法のためのpolyclonal の抗体を浄化することはよいどんなに直接使用することができる。

Polyclonal の抗体の準備

先生によってデイヴィッドBowtell プロトコルに基づかせている

マウスの免疫:

polyclonal の抗体の生成のためのマウスをimmunize 注入は少なくとも2 週の間隔で別になされるべきである。

ずっと次の2 つのアジェバントは正常である:

• Freund のアジェバント及びMPL+TDM のアジェバント(RIBI ImmunoChem Research 、Inc.) 。MPL は最初のアジェバントよりより少なく危険である。

1. 最初の免疫の注入のため: 15 - 50 ug をsubcutaneously 注入される200 のUL のアジェバントの抗原なら注入しなさい。
2. 第2 注入は後で行われるべきである2 週; アジェバントの抗原の15 - 50 ug とそれから後押ししなければならない。時間が割り当てれば(、後で月再度後押ししなさい) 。
3. 7 から10 日後でスクリーニングのために使用される試金を使用してマウス及びテスト血清を出血させる。力価が十分に高くなければ、再度倍力前の倍力の後の2 週。

上

血清の準備:

1. 収集の後で、血が60 分の間凝固するべきである。4.C の37.C かO.N 。
2. pasteur のピペットを使用して管(鳴ること) の側面から血塊を分けなさい。4.C O.N に血塊を置きなさい。
3. 血清を分けるために4.C で10 min. の10000 x g で回しなさい。
4. 血清は50% へのグリセロールを追加した後-20.C で保存することができる。

monoclonal 抗体が望まれれば、"よい" polyclonal および信頼できる選別法を次のステップに進んでもらえば。

上

ウサギ:

ウサギは上記されているように本質的にimmunized 。注入:

1. 最初にFreund の完全な100-200ug/1ml 注入で、2 つのサイト(各肩に) 。
2. 上として不完全なFreund の後で二番目に1 か月。
3. 裁ち切り後で2 週。倍力再度後で2 週(2 の+ 2 週のサイクル) 。

上

 

ウサギ(NEUSEELAND の白) のPOLYCLONAL の抗体の生産

Dr.Walter ステファン著プロトコルに基づかせている。

ウサギは古い重量及び約3 か月の3-4 キログラムのべきである。ウサギの三番目について他の色々な細胞コン�&ーネントのための内生反ケラチンの抗体そしてimmunoactivity を持ちなさい。これはある特定のウサギからの前免疫がある血清を取る重要性を強調する。

バッファ及び解決:

• 飽和させたアンモニウムの硫酸塩の解決、2 ミリメートルのEDTA 、pH 8.0
• アセテート50 ミリメートルのアンモニウムの、pH 8.0
• 70% のエタノール
• Freund のアジェバント(完全及び不完全)
• 隣酸塩は塩を緩衝した(PBS) (次に見なさい)
• ワセリン
• キシレン

上

• ケージからのウサギを持って来、耳をアクセス可能去る抑制ボックスにしっかり置きなさい。ウサギの平静を比較的保ちなさい。血のボリュームは耳の背面の表面の中心の下でランする主要な動脈から50 ML まで容易に集めることができる。
• 髭そりは新しいかみそり刃によって左の静脈のまわりで耳を残した。
• 70% のエタノールまたはイソプロパノールが付いている綿棒の耳。
• 膨張するべき動脈静脈のループのまわりのキシレンが付いている綿棒の耳。
• 膨張させた動脈に耳(しっかりと) および1 つの手のそしてフリーハンドの挿入が付いているコレクションの管の先端を19G 皮下針保持しなさい。血はコレクションの管にすぐ流れ始めるべきである。最もよい結果の場合耳に沿って中間動脈の部分を使用しなさい。
• 50 ML まで血集めなさい。停止出血に前方針のエントリの�&イントに圧力をちょうど適用しなさい。
• キシレンの苛立ちをなだめるために耳にワセリンを加えなさい。
• 切口に余分ワセリンを置きなさい。

血清の取得:

上

• 表面に塗り、管に血塊の接続機構を防ぐ集められた血の渦巻管。
• 1 時間37 oC でIncubate 。
• 10 分の間2,500 g (臨床テーブルの上の) の設定#7 遠心分離機。
• 血塊を除去し、10 分の間3,000 g で血清を回しなさい。
• 血清はフリーズされて保存されるべきである。

血清(冷蔵室で遂行される4 oC) からのIgG のアンモニウムの硫酸塩の沈殿物:

アンモニウムの硫酸塩の沈殿物はIgG のかなり純粋な一部分を得る容易な方法である。

上

• 1 匹のウサギからのプール血清
• 重量の血清
W1 = _____ g
• 分の洗浄管。PBS は再度重量を量り。
W2 = _____ g
• W2 によって飽和させるアンモニウムの硫酸塩、2 ミリメートルのEDTA 、pH 8.0 の2/3 のボリュームを追加しなさい
注: 4 oC でかき混ぜている間非常にゆっくり、dropwise 追加するかまたは蠕動性�&ンプを使用しなさい。
• 15 分の間かき混ぜなさい。
• 40 ML の遠心分離機管への転送; PBS 3 部のが付いている洗浄ビーカー: 2 部のアンモニウムの硫酸塩は管に追加し。
• 12,000 g (Beckman JA-20 の回転: 10 分の10,000 のrpm) 。
• 不用物の上澄み。
• PBS [ 1/2 W1 = 1/2 Vol. 。] の餌をResuspend 。
• 10 分の不用物の餌の間12,000 g で回しなさい。
• ビーカー、PBS の洗浄壁の上澄みを集めなさい。
W3 = _____ 定めなさい
• 2/3 のVol. を追加しなさい。W3 はかき混ぜている間アンモニウムの硫酸塩を飽和させた。15 分の間かき混ぜ続けなさい。
• 40 ML の遠心分離機管に中断、PBS/ammonium の硫酸塩の解決が付いている洗浄管を転送しなさい。
• 10 分の間12,000 g で回しなさい。
• 上澄みを廃棄しなさい。
• 1/4 W1 PBS の餌をResuspend 。
• PBS の3 時間に対してそれぞれ6 時間透析しなさい。
• 累進的な管に血清、洗浄の透析袋をPBS とよく置きなさい。
• 1/2 までW1 = PBS の1/2 Vol. 持って来なさい。
• 記憶のための蛋白質の集中そして因数を定めなさい。280 nm で吸収を測定しなさい。1 つのmg/ml IgG の解決の吸収はおよそ1.5 である。

免疫:

上

• 2.2 ML で~400-600 g の抗原 (1 注入毎の~200-300 g) をアセテートアンモニウムの、pH 8.0 または他適切なバッファ50 ミリメートルの分解しなさい。集中は注入されるべき蛋白質のantigenicity に左右される。
• 抗原の量はそれに依存する免疫のantigenicity そして方法動物をimmunize 必要があった。低いantigenicity の蛋白質が使用されれば、SDS (0.2% まで) の低い集中の蛋白質を変化させることは有用である。非常に浄化された抗原しかpolyclonal の抗体の生産に使用するべきでない。純粋な抗原を得る容易な方法はSDS-PAGE によって行う。蛋白質は硝酸セルロースのシートに転送され、Ponceau S と、かみそり刃によって切れるために汚れ、抗原として使用することができる(SDS-PAGE の標準プロトコルを捜しなさい) 。
• 20G 皮下針が付いている1.1.ml Freund の完全なアジェバントの上で引きなさい、次に1.1 ML の抗原の解決の上で引きなさい。倍力のための残りの1.1 ML をフリーズしなさい。
• プランジャを不動保って、針を除去し、生殖不能の三方stopcock を接続しなさい。
• 第2 ガラスス�&イトをstopcock に前後に接続し、注入によってアジェバントと抗原を混合しなさい。(注意: あるプラスチックス�&イトはミネラルオイルと。反応するかもしれない)
• 完全な乳剤は約20-30 分後に形作られる; 解決の粘着性の幾分突然の増加によって示される。

注意: 土台が安全であることを確かめなさい!
• 混合の待ち時間の後不完全なら混合物が完全であること制御への注入の前の約20 分(、オイルは分かれる) 。
• 肩甲骨からの骨盤へのウサギの髭そり。
• 70% のエタノールかイソプロパノールときれいにしなさい
• 21G 皮下針を使用して肩甲骨と骨盤間の脊柱に沿う約10-20 の側面に皮の下で注入しなさい。(ノート: 最初注入最後のpreimmune の出血の後の1 週) 。
• 待ち時間抗原及び不完全なアジェバントの混合物との1 つの月そして倍力。前の注入からの傷を避けなさい。
• 免疫があ応答があるように確認するために1 週後に出血させなさい。倍力は免疫反応が余りに弱かったら繰り返されるべきである; 但し、別のウサギはウサギが全然/LI > 反応しなかったら選択されるべきである

参照: Garvey 、J.S. 、Cremer 、N.E. 、及びSussdorf 、D.H. (1977 年) の: 免疫学の方法。パブ。Benjamin/Cummings Publishing Company 。読書は集中する。PP 545

上

ELISA の試金を使用してPolyclonal の抗体のスクリーニング

抗体スクリーンのためのELISA のプロトコル:

ELISA のための材料:

. の版- 96 井戸Dynatech Immulon のタイプ2 。(フィッシャー17-0221-199) 。

. PBS 、TBS

. PBS + 0.1% Tween 20 またはTBS + 0.1% Tween 20 。

解決を妨げる. = タイプ2% BSA (v) PBS の。(長期保管のための0.02% のアジ化物を。追加しなさい)

. のElisa バッファ= 2% BSA + PBS (任意選択アジ化物) の0.1% Tween 20 。

. の酵素は抗体= Horseradish の過酸化酵素1 をリンクした

. の基板= ABTS - 100X (Zymed 00-2001)1 から

. HRP バッファ: 100mM のNa のクエン酸塩pH 4.2(490 のマグネシウムのクエン酸+ 720 マグネシウムのNa のクエン酸塩

二水化物+ 50 ML H2.O 、pH 4.2) 。

. の過酸化水素30% (1000X)

上

Polyclonal の抗体のためのELISA のプロトコル

1) 抗原のADSORBTION

a) PBS の10 ug/ml へのDilute Ag 。

b) それぞれにAg の解決の100 つのUL をよく追加しなさい。

c) O.N を、4.C でsaran 覆いで覆われて残しなさい。

2) 妨害

a) 版を逆さにし、井戸を打つことによる洗浄自由なAg は乾燥する。

b) PBS をそれぞれへの井戸再度追加し、逆さにすることによる洗浄(使用はびんを吹き出す) 。

c) 洗浄を二度繰り返しなさい。

d) 解決をあらゆるによく妨げることの100 つのUL を追加しなさい、部屋の臨時雇用者で1 時間か4.C でO.N を残しなさい。

3) 一次抗体

a) テストされるべき抗体を追加しなさい:

セルの一口は上下にpipeting によって= 25 のUL 、よく混合する(10 回) 。

血清、腹水= 1:100 および希薄1/5 ののserie 。解決の妨害の希薄をしなさい。

b) 部屋の臨時雇用者で1 時間か4.C でO.N を残しなさい。

4) 二次抗体

a) 洗浄自由な抗体4 回とのPBS + 0.1% Tween 20 。

b) すべての井戸に酵素によってリンクされる抗体の100 つのUL を追加しなさい。Elisa バッファの適切な希薄をしなさい。(前: HRP は2000X である) 。

c) 許可部屋の臨時雇用者の1 時間か4.C のO.N 。

5) 基板

a) 水のDisolve の基板。

b) 洗浄版4 回とのPBS + 使用TBS 0.1% Tween 20 (AP のためのPBS の代りの) 。

c) あらゆる井戸に基板の100 つのUL を追加しなさい。

d) カラー開発を見なさい。これは数秒から20 分に取ることができる。

e) 必要とされたら、4M のNaOH の50 のUL の追加によって反作用を停止しなさい。

f) 正しい波長でElisa の読取装置の吸収を読みなさい(AP - 405 nm のためのHRP システム416 nm のために、) 。

上

他の抗体のウェブサイト

抗体が 端末 抗体、抗体の製造者、および他の抗体関係した情報をカバーする新しいサイトであることを見なさい。

他の抗体および関連Monoclonal 抗体のトピックをここに見つけなさい: