Transfezione delle cellule

La transfezione descrive l'introduzione di materiale straniero nelle celle eucariotiche usando un vettore del virus o altri mezzi di trasferimento.

La transfezione di termine per i metodi non-virali è più usata spesso nel riferimento alle cellule di mammiferi, mentre la trasformazione di termine è preferita per descrivere il trasferimento non-virale del DNA in batteri e celle eucariotiche non animali quali i funghi, le alghe e le piante.

La transfezione delle celle animali coinvolge tipicamente aprire i pori o “i fori„ transitori nella membrana di plasma delle cellule, per permettere la comprensione di materiale. Il materiale genetico (quali le costruzioni supercoiled del DNA o del siRNA del plasmide), o persino le proteine quali gli anticorpi, può transfected. Oltre che l'elettroporazione, la transfezione può essere effettuata mescolando un lipido cationico con il materiale per produrre i liposomi, che fondono con la membrana di plasma delle cellule e depositano il loro carico all'interno.

Il significato originale della transfezione era “infezione da trasformazione„, cioè introduzione di DNA (o di RNA) da un virus o da un batteriofago dell'eucariota nelle celle, con conseguente infezione. Poiché la trasformazione di termine ha avuta altro senso nella biologia animale delle cellule (un cambiamento genetico permettendo propagazione a lungo termine nella coltura, o nell'aquisizione delle proprietà tipiche delle cellule tumorali), la transfezione di termine ha acquistato, per le celle animali, il relativo significato attuale di un cambiamento nelle proprietà delle cellule causate dall'introduzione di DNA.

La transfezione è un metodo da cui il DNA sperimentale può essere messo in una cellula di mammiferi coltivata. Tali esperimenti sono effettuati solitamente usando il DNA clonato che contiene le sequenze di codificazione e le regioni di controllo (promotori, ecc) per provare se il DNA sarà espresso. Poiché il DNA clonato può essere modificato estesamente (per esempio, i luoghi obbligatori della proteina sul promotore possono essere alterati o rimossi), la transfezione è usata spesso provare se una modifica particolare interessa la funzione di un gene.

Schema di transfezione:

Applicazioni di transfezione

La capacità di sintetizzare il RNA in laboratorio è critica a molte tecniche. Le sonde radioattive e non-radioattive del RNA sono richieste per molti protocolli e possono essere sintetizzate facilmente nelle reazioni in vitro della trascrizione della piccola scala permettendo il loro uso nelle ibridazioni della macchia e nelle analisi di protezione della nucleasi.

• Vettore o DNA
• Celle
• Reagente di transfezione

La trascrizione in vitro richiede un modello lineare purificato del DNA che contiene un promotore, i trifosfati del ribonucleotide, un sistema del buffer che include DTT ed il magnesio

La trascrizione in vitro richiede un modello lineare purificato del DNA che contiene un promotore, i trifosfati del ribonucleotide, un sistema del buffer che include DTT ed il magnesio

Metodi di transfezione

Ci sono vari metodi di presentazione del DNA straniero in una cella eucariotica. Molti materiali sono stati usati come elementi portanti per la transfezione, che può essere divisa in tre generi: polimeri, liposomi e nanoparticles (cationici).

Uno (e meno certi) dei metodi più poco costosi sono transfezione dal fosfato di calcio, originale scoperto dal F.L. Graham ed A.J. van der Eb in 1973 [citazione stata necessaria] (vedi inoltre [1]). la soluzione salina HEPES-bufferizzata (HeBS) che contiene gli ioni del fosfato è unita con una soluzione del cloruro di calcio che contiene il DNA da transfected. Quando i due sono uniti, un precipitato fine - calcio caricato e negativamente - del fosfato caricato si formerà positivamente, legando il DNA da transfected sulla relativa superficie. La sospensione del precipitato allora si aggiunge alle celle da transfected (solitamente una coltura delle cellule sviluppata in uno strato monomolecolare). Tramite un processo non interamente capito, le celle gli prendono alcuno del precipitato e con, il DNA.

Altri metodi usano i residui organici molto ramificati, cosiddetti dendrimers, per legare il DNA e per entrarli nella cella. Un metodo molto efficiente è l'inclusione del DNA da transfected in liposomi, cioè piccoli, enti membrana-limitati che sono per alcuni versi simili alla struttura di una cella e possono realmente fondere con la membrana delle cellule, scaricanti il DNA nella cella. Per le celle eucariotiche, il lipido-catione basato transfezione è usato più tipico, perché le celle sono più sensibili.

Un altro metodo è l'uso dei polimeri cationici quali Deae-dextrano o il polyethylenimine. Negativamente - il DNA caricato lega al polycation ed il complesso è preso dalla cella via il endocytosis.

Un metodo diretto alla transfezione è la pistola del gene, in cui il DNA è accoppiato ad un nanoparticle di un solido inerte (comunemente oro) che allora “è sparato„ direttamente nel nucleo delle cellule di obiettivo. Il DNA può anche essere introdotto nelle celle usando i virus come elemento portante. In tali casi, la tecnica è chiamata trasduzione virale e, le celle sarebbe transduced.

Altri metodi di transfezione includono il nucleofection, elettroporazione, scossa di calore, magnetofection e reagenti riservati di transfezione quale Lipofectamine, Dojindo Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene o DreamFect.

Scuderia contro i metodi transitori di transfezione

Per la maggior parte delle applicazioni della transfezione, è sufficiente se il gene transfected è espresso soltanto transitoriamente. Poiché il DNA introdotto nel processo di transfezione non è inserito solitamente nel genoma nucleare, il DNA straniero è perso allo stadio avanzato quando le celle subiscono la mitosi. Se è voluto che il gene transfected realmente rimane nel genoma della cella e delle relative celle di figlia, una transfezione stabile deve accadere.

Per compire questo, un altro gene è co-transfected, che dà alla cella un certo vantaggio di selezione, quale la resistenza verso una determinata tossina. Alcune (molto pochi) delle celle transfected, avranno inserito per caso il materiale genetico straniero nel loro genoma. Se la tossina, verso cui il gene co-transfected offre la resistenza, allora si aggiunge alla coltura delle cellule, solo quelle poche celle con i geni stranieri inseriti nel loro genoma potranno proliferare, mentre altre celle moriranno. Dopo l'applicazione della questa pressione di selezione per un po di tempo, soltanto le celle con una transfezione stabile rimangono e possono essere coltivate più ulteriormente.

Un agente comune per la transfezione stabile è Geneticin, anche conosciuto come G418, che è una tossina che può essere neutralizzata dal prodotto del gene resistente della neomicina.

La trascrizione in vitro richiede un modello lineare purificato del DNA che contiene un promotore, i trifosfati del ribonucleotide, un sistema del buffer che include DTT ed il magnesio

Punte per la transfezione

• Usi sempre gli inibitori della RNAsi!
• Soldi di risparmio con la polimerasi dei fagi del RNA T7: I cloni con una modifica del N-terminale His-6 sono disponibili. Se ottenete questo clone, potete purificare i grandi numeri della polimerasi T7 con alta attività (riferimento: Lui B, Rong m., Lyakhov D, Gartenstein H, Diaz G, Castagna R, PESO di McAllister, Durbin RK. Proteina Expr Purif. 1997, 9, 142-151).
• Per rimuovere il modello del DNA, usi una dnasi RNAsi-libera. Abbiamo usato RQ1 la dnasi (Promega) aggiunta per 15 minuti e funziona bene. 

Memorizzazione del reagente di Trasfection

• Il RNA è memorizzato il più bene ad un pH neutro con l'EDTA.
• Il buffer di TE è suggerito (EDTA dell'Tris-HCl, di pH 7.5, da 1 millimetro di 10 millimetri), comunque questo dovrebbe essere preparato con RNAsi purificata liberamente (preferablly acqua del Millipore).

Problemi di transfezione di eliminazione dell'errore

Transfezioni guastate

• Vecchio reagente di transfezione
• Agente impropriamente memorizzato di transfezione
• DNA di qualità scadente o vettore
• Importo insufficiente del DNA
• Reagente insufficiente di transfezione
• Troppo DNA
• Troppo reagente di transfezione

Riferimenti sulla transfezione

Riferimenti sulla transfezione

1. Bacchetti S, Graham F (1977). “Trasferimento del gene per la chinasi della timidina nelle celle umane chinasi-carenti della timidina dal DNA virale purificato di simplex di erpete„. Proc Acad nazionale Sci S.U.A. 74 (4): 1590-4. PMID 193108.