Collegamento del membro
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Ottenendo l'alta qualità, il RNA intatto è la prima e spesso maggior parte della tappa critica nell'effettuazione dei molti esperimenti fondamentali di biologia molecolare, compreso l'analisi nordica, le analisi di protezione della nucleasi, RT-PCR, RNA che tracciano, la traduzione in vitro e la costruzione della libreria del cDNA. Per riuscire, tuttavia, la procedura di isolamento del RNA dovrebbe comprendere alcuni punti importanti entrambi prima e dopo la purificazione reale del RNA.
Secondo il RNA da estrarre, ci sono proprietà di RNA che permettono che siano isolati a partire da altri materiali cellulari quali le proteine, DNA e perfino lipidi.
Il RNA di messaggero o il mRNA contiene i residui dell'adenosina di stirata sotto forma d'una poli coda (A). Ciò è stata sfruttata per permettere che il mRNA sia limitato a poli (T) colonne o branelli di affinità.
Se corrente avete un metodo preferito per l'isolazione del RNA, continui ad usarlo.
Se non isoliate il RNA dal vostro sistema prima che ed il vostro organismo non sia sulla seguente lista, possiamo aiutarli ad identificare i protocolli stabiliti che sono stati usati per l'isolazione il RNA per macchiare nordico o del RT-PCR dal vostro sistema. Questi tipi di protocolli egualmente renderanno il RNA “del microarray-grado„.
Esegua sempre un gel dell'agarosi del vostro RNA per valutare la qualità.
NOTA: Se usate non un reagente di purificazione basato colonna quale TRIzol che lo suggeriamo precipitiamo il vostro RNA una seconda volta da etanolo o lo passate tramite una colonna di Rneasy o una simile unità. Ciò assicura la rimozione di tutti gli agenti inquinanti organici (vedi gli spettri qui sotto).
Frazionamento nucleare/citoplasmico efficiente può essere valutato rapidamente denaturando l'analisi del gel dell'agarosi (si veda figura 1). Le fasce che corrispondono al rRNA del precursore dovrebbero essere equivalenti nella frazione totale e nucleare del RNA. Le fasce del rRNA 18S e 28S saranno meno intense nella frazione nucleare del RNA che in RNA di totale o RNA citoplasmico della frazione. In alcune varietà di cellula, per esempio 293 e le celle COS-7, questa differenza sarà drammatica, ma in altre righe delle cellule quali le celle HeLa, le fasce del rRNA sono soltanto un po'meno intense in RNA nucleare che in RNA totale o citoplasmico della frazione. “
Le letture A260 e 260/280 di rapporti non sono abbastanza per accertare il RNA di elevata purezza. Dovete prendere uno spettro UV completo. Sotto sono 3 spettri di esempio che tutti hanno buon 260/280 di rapporti, ma hanno purezze molto differenti. Potete anche usare il rapporto di 260/230 per contribuire a determinare la quantità di contaminazione organica in vostro RNA. È un numero molto più variabile che il rapporto di 260/280, ma generalmente, i rapporti superiore a 1 indicano la buona purezza.
Le celle allora sono state lavate in PBS e successivamente hanno estratto come descritte. In primo luogo, le celle sono state estratte con il buffer di Nonidet P-40 (10 millimetri di Tris-Cl, (pH 7.5), 10 millimetri di NaCl, 3 millimetri di MgCl2, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 millimetro DTT). La pallina restante (reticolo endoplasmico di massima (RER) e nucleo) è stata lavata nello stesso buffer ed è stata estratta nel buffer la B (10 millimetri di Tris-Cl (pH 7.5), 10 millimetri di NaCl, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, un EDTA da 40 millimetri, 40 units/ml Rnasin, 1 millimetro DTT). La pallina nucleare restante è stata lavata nello stesso buffer ed è stata estratta con l'alto buffer del sale (10 millimetri di Tris-Cl (pH 7.5), un NaCl da 0.5 m., 3 millimetri di MgCl2, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 millimetro DTT). Il RNA è stato purificato da ogni frazione dalla soluzione di STAT del RNA. Il RNA totale è stato isolato usando RNA-STAT60 il reagente (Telefono-prova) secondo le istruzioni fornite dal fornitore. (Riferimento: Byeong-Churl Jang ed altri, 2002)
Per 100 mls 200 mls
4. EDTA 0.5M di g 106.4 2% N-lauroylsarcosine (sarcosyl) 2.0g 4.0g 50mM del tiocianato 53.2 di 5M Guanidinium 10 Tris-HCl dei mls 25mM dei mls 20, pH 7.5 1M 2.5 mls 5 mls
0. b-mercaptoetanolo 700ul 1.4mls di 1M
0. antischiume A (sigma) di 2% 200 UL dell'UL 400
5. volume finale del cushion* da 7 m. CsCl 100 ml
5. 7 m. CsCl “cotto„ 95.8g
0. EDTA 0.5M di 1M 20 mls
* Usi l'acqua trattata DEPC e la cristalleria cotta. Questa soluzione, assolutamente, positivamente deve essere RNAsi liberamente. La RNAsi è dappertutto! Porti i guanti, la cristalleria cotta di uso soltanto, o la plastica vergine. Ossequio di DePC la vostra acqua, buffer (tranne Tris). Stia molto attento.
1. Pesi l'animale. Rimuova l'organo (fegato), appesantisca uno degli attributi superiori di cDNA è voi riducono la complessità del gene scegliendo un organo che esprime soltanto un singolo luogo di un enzima di multilocus. 2. Omogeneizzi velocemente il tessuto nella rotazione 3. del buffer “di caos„ (9mls) homogenant a 12 chilogrammi per rimuovere il materiale insolubile 4. MENTRE Homogenant STA FILANDO 4A. Pesi 1.8 g di CsCl (0.2g/ml) per campione. 4B. Nel tubo dell'ultracentrifuga (“rapido-guarnizione„) aggiunga 3.5mls di 5.7M CsCl “ammortizzatore„ che questo strato deve essere RNAsi liberamente. Centrifugherete il vostro RNA con questo strato e tutta la contaminazione causerà le perdite significative. 5. Rimuova supernant, messo nel tubo fresco, aggiunga 1.8 il g CsCl 6. con attenzione, aggiunga homogenant in cima all'ammortizzatore di CsCl. Ciò fa il più prontamente usando una siringa 10cc e un ago lungo. Disponga l'ago/siringa nel tubo della rapido-guarnizione ed aggiunga il tessuto homogenant alla siringa. Homogenant gocciolerà lentamente nel tubo di Q-S, galleggiante in cima all'ammortizzatore.
7. Con attenzione, accoppiamenti abbinati dell'equilibrio del tubo centrifugo (+-0.005 g).
8. Tubi di guarnizione, opposto dei tubi abbinato posto di a vicenda e protezione con le parti superiori di alluminio rosse.
9. Centrifuga, 50.000 rpms 5.5 ore, 20oC
Dopo centrifugazione: Contrassegni i tubi in cui la pallina dovrebbe essere: dal lato esterno inferiore (riguardante il centro del rotore)
10. Rimuova i tubi, disponga in cremagliera conveniente.
11. Affetti fuori dalla parte superiore del tubo. Aspiri fuori dal 2/3- principale 3/4 della soluzione. FUNZIONI DALLA PARTE SUPERIORE GIÙ. È IMPORTANTE CHE ASPIRATE FUORI DALLA TOMAIA LA MAGGIOR PARTE DELLA SOLUZIONE IN PRIMO LUOGO E RIMUOVETE TUTTI MA L'AMMORTIZZATORE LIBERO. NON ASPIRI LA PALLINA INVISIBILE ALLA PARTE INFERIORE.
12. Tagli il 2/3 principale del tubo. Usando un Pasteur “tirato„ pipetti, con attenzione rimuova la soluzione restante. La pallina sarà sul lato inferiore del tubo.
13. Risciacqui la pallina con 70% EtOH, rimuova (uso Pasteur pipetta), ripeti due volte (totale 3 lava)
14. Aggiunga l'UL 200 di 0.1x TE (RNAsi libera), usando la punta di prelevamento alla pallina di schiacciamento e “titolando„ il tentativo del T.E. di mettere la pallina nella soluzione. Formi almeno una soluzione eterogenea e metta in un tubo fresco del microfuge.
15. Ripeti con l'UL 200 del T.E. che riunisce entrambe le soluzioni
16. Il vortice, buon RNA non gradice entrare in soluzione. La pazienza è una virtù.
17. Determini la concentrazione, l'UL 10 490 nell'UL (500 volumi finali dell'UL)
18. Eliminano 1 - 2 ug di RNA per l'analisi del gel (aggiungono i buffer di caricamento del RNA)
19. Aggiungono una RNAsi 3M libero NaOAC (40 UL), 2.5 volumi del 1/10 di volume di EtOH (1.0ml). Miscela vigoroso.
20. Potete calcolare la concentrazione di RNA nel EtOH.Thus, là siete necessità di precipitare tutto il vostro RNA immediatamente. Appena rimuova circa 1.5 - 2 volte l'importo che avete bisogno di vortexing la soluzione di EtOH/RNA e rimuova il volume adatto. Questa soluzione di EtOH/RNA memorizzata a 20oC o si abbassa, è stabile per gli anni.
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