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Biologia Molecolare - Virgolette Di Scienza

Necessità di scienza e di etica di agitare le mani. ~Richard Clarke Cabot

Bollettino Molecolare Di Biologia!

Alberini Recenti Della Tribuna

Isolamento del RNA

Informazioni di base Dell'Estrazione del RNA

Ottenendo l'alta qualità, il RNA intatto è il primo ed il punto più critico nell'effettuazione molta biologia molecolare fondamentale sperimenta spesso, compreso analisi nordica, le analisi di protezione della nucleasi, RT-PCR, RNA che tracciano, la traduzione in vitro e costruzione della libreria del DNA. Riuscire, tuttavia, la procedura di isolamento del RNA dovrebbe includere alcuni punti importanti entrambi prima e dopo la purificazione reale del RNA.

Metodi Di base Di Isolamento del RNA

Secondo il RNA da estrarre, ci sono proprietà di RNA che permettono che sia isolato via da altri materiali cellulari quali le proteine, DNA e perfino lipidi.

Il RNA o il mRNA del messaggero contiene i residui dell'adenosina di stirata sotto forma d'una coda del poly(A). Ciò è stata sfruttata per permettere che il mRNA sia limitato alle colonne o ai branelli di affinità del poly(T).

Punte per l'estrazione e l'isolamento del RNA

Se attualmente avete un metodo preferito per l'isolamento del RNA, continui ad usarlo.

Se non avete isolato il RNA dal vostro sistema prima che ed il vostro organismo non sia sulla seguente lista, possiamo aiutarli ad identificare i protocolli stabiliti che sono stati usati per l'isolamento il RNA per macchiarsi nordico o del RT-PCR dal vostro sistema. Questi tipi di protocolli egualmente renderanno il RNA "del microarray-grado".

Faccia funzionare sempre un gel dell'agarosi del vostro RNA per valutare la qualità.

NOTA: Se usate non un reagente di purificazione basato colonna quale TRIzol che li suggeriamo precipitiamo il vostro RNA una seconda volta da etanolo o lo passate tramite una colonna di Rneasy o un dispositivo simile. Ciò assicura la rimozione di tutti gli agenti inquinanti organici (veda gli spettri qui sotto).

Inibitori della RNAsi usati nell'estrazione e nell'isolamento del RNA

Controllo qualità e della quantità di isolamento del RNA

Il frazionamento efficiente di nuclear/cytoplasmic può essere valutato rapidamente da analisi denaturante del gel dell'agarosi (si veda figura 1). Le fasce che corrispondono al rRNA del precursore dovrebbero essere equivalenti nella frazione totale e nucleare del RNA. Le fasce di rRNA 18S e 28S saranno meno intense nella frazione nucleare del RNA che in RNA di totale o RNA citoplasmico della frazione. In alcune righe delle cellule, per esempio 293 e le cellule COS-7, questa differenza sarà drammatica, ma in altre righe delle cellule quali le cellule heLa, le fasce di rRNA sono soltanto un po'meno intense in RNA nucleare che in RNA totale o citoplasmico della frazione."

Purezza del RNA

Le letture A260 e 260/280 di rapporti non sono abbastanza per accertare il RNA di elevata purezza. Dovete prendere uno spettro UV completo. Sotto sono 3 spettri di esempio che tutti hanno buon 260/280 di rapporti, ma hanno purezze molto differenti. Potete anche usare il rapporto di 260/230 ad aiuto determinate la quantità di contaminazione organica in vostro RNA. È un numero molto più variabile che il rapporto di 260/280, ma generalmente, i rapporti superiore a 1 indicano la buona purezza.

Misura l'estrazione e dell'isolamento del RNA

Isolamento del RNA dalle frazioni sottocellulari

Le cellule allora sono state lavate in PBS e successivamente hanno estratto come descritte. In primo luogo, le cellule sono state estratte con l'amplificatore di Nonidet P-40 (10 millimetri di Tris-Cl, (pH 7.5), 10 millimetri di NaCl, 3 millimetri di MgCl2, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 millimetro DTT). La pallina restante (reticolo endoplasmico di massima (RER) e nucleo) è stata lavata nello stesso amplificatore ed è stata estratta nell'amplificatore la B (10 millimetri di Tris-Cl (pH 7.5), 10 millimetri di NaCl, 0.5%(v/v) Nonidet P-40, un EDTA da 40 millimetri, 40 units/ml Rnasin, 1 millimetro DTT). La pallina nucleare restante è stata lavata nello stesso amplificatore ed è stata estratta con l'alto amplificatore del sale (10 millimetri di Tris-Cl (pH 7.5), un NaCl da 0.5 m., 3 millimetri di MgCl2, 0.5%(v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 millimetro DTT). Il RNA è stato purificato da ogni frazione dalla soluzione di STAT del RNA. Il RNA totale è stato isolato usando RNA-STAT60 il reagente (Telefono-prova) secondo le istruzioni fornite dal fornitore. (riferimento: Byeong-Churl Jang ed altri, 2002)

Isolamento del RNA Usando Protocollo Di CsCl

Amplificatore di caos per isolamento del RNA

Per 100 mls 200 mls

4. EDTA 0.5M di g 106.4 2% N-lauroylsarcosine (sarcosyl) 2.0g 4.0g 50mM del tiocianato 53.2 di 5M Guanidinium 10 mls 20 mls 25mM Tris-HCl, mls del 1M 2.5 di pH 7.5 5 mls

0. b-mercaptoetanolo 700ul 1.4mls del 1M

0. antischiuma A (sigma) di 2% 200 UL dell'UL 400

5. un ammortizzatore da 7 m. CsCl * volume finale 100 ml

5. 7 M. CsCl "Cotto" 95.8g

0. EDTA 0.5M del 1M 20 mls

Procedura Dell'Estrazione del RNA Usando CsCl

* Usi l'acqua trattata DEPC e la cristalleria cotta. Questa soluzione, assolutamente, positivamente deve essere RNAsi liberamente. La RNAsi è dappertutto! Porti i guanti, la cristalleria cotta di uso soltanto, o la plastica vergine. Ossequio di DePC la vostra acqua, amplificatori (tranne Tris). Faccia attenzione molto.

1. Pesi l'animale. Rimuova l'organo (fegato), appesantisca uno degli attributi superiori di DNA è voi riducono la complessità del gene scegliendo un organo che esprime soltanto un singolo luogo di un enzima di multilocus. 2. Omogeneizzi velocemente il tessuto nell'amplificatore "di caos" (9mls) 3. Fili homogenant a 12 chilogrammi per rimuovere il materiale insolubile 4. MENTRE Homogenant STA FILANDO 4A. Pesi 1.8 g di CsCl (0.2g/ml) per il campione. 4B. Nel tubo dell'ultracentrifuga ("rapido-guarnizione") aggiunga 3.5mls di 5.7M CsCl "ammortizzatore" che questo strato deve essere RNAsi liberamente. Centrifugherete il vostro RNA con questo strato e tutta la contaminazione causerà le perdite significative. 5. Rimuova supernant, messo nel tubo fresco, aggiunga 1.8 il g CsCl 6. Con attenzione, aggiunga homogenant in cima all'ammortizzatore di CsCl. Ciò fa il più prontamente usando una siringa 10cc e un ago lungo. Disponga needle/syringe nel tubo della rapido-guarnizione ed aggiunga il tessuto homogenant alla siringa. Homogenant gocciolerà lentamente nel tubo di Q-S, galleggiante in cima all'ammortizzatore.

7. Con attenzione, l'equilibrio ha abbinato gli accoppiamenti del tubo centrifugo (+-0.005 g).

8. I tubi di guarnizione, posto hanno abbinato l'opposto dei tubi a vicenda e della protezione con le parti superiori di alluminio rosse.

9. Centrifuga, 50.000 rpms 5.5 ore, 20oC

Dopo centrifugazione: Contrassegni i tubi in cui la pallina dovrebbe essere: dal lato esterno inferiore (riguardante il centro del rotore)

10. Rimuova i tubi, disponga in cremagliera conveniente.

11. Affetti fuori della parte superiore di tube.Aspirate fuori del 2/3- principale 3/4 della soluzione. FUNZIONI DALLA PARTE SUPERIORE GIÙ. È IMPORTANTE CHE ASPIRATE FUORI DELLA TOMAIA LA MAGGIOR PARTE DELLA SOLUZIONE IN PRIMO LUOGO E RIMUOVETE TUTTI MA L'AMMORTIZZATORE LIBERO. NON ASPIRI LA PALLINA INVISIBILE ALLA PARTE INFERIORE.

12. Tagli il 2/3 principale del tubo. Usando un Pasteur "tirato" pipetti, con attenzione rimuova la soluzione restante. La pallina sarà sul parte-lato del tubo.

13. Risciacqui la pallina con 70% EtOH, rimuova (uso Pasteur pipetta), ripeti due volte (totale 3 si lava)

14. Aggiunga l'UL 200 di 0.1x TE (RNAsi libera), usando pipettano la punta per schiacciare la pallina e "la titolazione" del tentativo di T.E. di mettere la pallina nella soluzione. Formi almeno una soluzione eterogenea e metta in un tubo fresco del microfuge.

15. Ripeti con l'UL 200 di T.E. che riunisce entrambe le soluzioni

16. Il vortice, buon RNA non gradisce entrare nella soluzione. La pazienza è una virtù.

17. Determini la concentrazione, l'UL 10 490 nell'UL (500 volumi finali dell'UL)

18. Elimini 1 - 2 ug di RNA per analisi del gel (aggiunga gli amplificatori di caricamento del RNA)

19. Aggiunga liberamente una RNAsi 3M NaOAC (del 1/10 di volume UL 40), 2.5 volumi EtOH (1.0ml). Miscela vigoroso.

20. Potete calcolare la concentrazione di RNA EtOH.Thus, là siete necessità di precipitare tutto il vostro RNA immediatamente. Appena rimuova circa 1.5 - 2 volte l'importo che avete bisogno di vortexing la soluzione EtOH/RNA e rimuova il volume adatto. Questa soluzione EtOH/RNA memorizzata a 20oC o si abbassa, è stabile per gli anni.

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