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Gel del RNA

Copyright 2007 - Stazione Molecolare

 

Storia di elettroforesi del gel del RNA

I gel del RNA sono stati usati per le decadi per separare fuori e per valutare qualitativamente la qualità di RNA isolata dai campioni. Se non siete sicuri che RNA è verifica:

AUDIO Ascolti una spiegazione dettagliata del RNA! e veda il nostro articolo dell'enciclopedia del RNA.

Elettroforesi Del Gel del RNA - Informazioni di base

Dopo isolamento dei campioni del RNA, la qualità del preparato di isolato il RNA è valutata solitamente tramite l'elettroforesi su un gel denaturante dell'agarosi. Anche se i risultati sono pricipalmente qualitativi, potete ottenere alcune informazione sul rendimento del RNA pure.

Denaturando i gel sono usati perché il RNA tende a piegarsi su se ed a formare la vasta e struttura secondaria stabile via l'accoppiamento basso intramolecolare. Questa struttura secondaria di RNA lo impedisce la migrazione pricipalmente secondo il relativo formato.

Assicurisi che includete un controllo positivo del RNA sul gel, nel caso che ottenete i risultati che insoliti potete allora determinare se il problema sia stato con il gel o sia stato un problema con il RNA state analizzando. Potete anche usare gli indicatori del peso molecolare del RNA, un campione del RNA conosciuto per essere intatti, o entrambi, possono essere usati a questo fine.

I gel del RNA sono visualizzati con il bromuro di etidio che macchia mentre il bromuro di etidio intercala fra la struttura secondaria delle molecole del RNA e che permette che il RNA sia visto sotto luce UV.

Il RNA è separato fuori tramite l'elettroforesi del gel (solitamente elettroforesi del gel dell'agarosi). Dopo il funzionamento del gel del RNA potete condurre una macchia nordica con il trasferimento successivo nella membrana, nell'ibridazione con la sonda ed infine nella rilevazione. O semplicemente (e molto più rapido), macchia per RNA usando il bromuro di etidio o SYBR (o tintura simile - migliore come esso è non tossico e più sicuro).

 

Applicazioni dei gel del RNA

Poichè le macchie nordiche sono molto più noiose da completare che i gel del RNA e PCR in tempo reale, non sono usate tanto quanto i gel del RNA.

L'elettroforesi del gel del RNA e le relative variazioni sono usate nella ricerca molecolare di biologia:

• rilevi il RNA
• analisi per qualità di RNA isolata
• tenga conto determinazione generale della quantità o del rendimento del RNA
• analisi per degradazione del RNA

Svantaggi dei gel del RNA

Gli svantaggi di usando l'elettroforesi del gel del RNA include:

• I gel del RNA non sono molto quantitativi. Non potete determinare precisamente il rendimento del RNA o ammontare neppure con gli standard. I metodi radioattivi quali le macchie nordiche del puntino o macchiarsi sono molto più esatti.
• Il bromuro di etidio è usato spesso per rilevare il RNA. Il bromuro di etidio è un biohazard poichè è mutageno e tossico.
• I gel del RNA tengono conto una determinazione rapida del rendimento del RNA tuttavia non sono velocemente quanto la spettrofotometria UV o altri metodi.

Vantaggi dei gel del RNA

I vantaggi dei gel del RNA includono:

• È un metodo ampiamente accettato
• I gel del RNA sono molto rapidi e facili effettuare
• Potete analizzare per qualità del RNA in 1-2 ore
• Se usate SYBR o un'altra macchia non tossica (cioè non usate il bromuro di etidio), i gel del RNA sono abbastanza sicuri.

Protocollo Del Gel del RNA

Per verificare l'integrità del vostro RNA dovreste fare "un'analisi della macchia nordica ". Per compire questo dovete fare funzionare un gel denaturante.

Per i Mini-gel ai Midi-gel di uso del RNA: Faccia 50 mL-100mL

Per i Mega-gel faccia 400 ml.

 

Per il gel 100mL (funzionato il più comunemente) dovete aggiungere 1g dell'agarosi per fare la soluzione dell'agarosi di 1%.

 

Ricetta corrente dell'amplificatore per i gel del RNA

Per prepararsi:	500mls	750 mls	1.5 litro
amplificatore del 1X E (50X)-below	10 ml	15 ml	30 ml
formaldeide di 0.66M (1/19 del volume)	26.3 ml	39.5 ml	79 ml

RNA Che Denatura I Reagenti

Per preparare 400ul di RNA che denatura reagente:

Aggiunga quanto segue:

• 300ul Foramide-deionizzato 80%
• 3.7 % dell'UL della formaldeide 40
• UL dell'amplificatore 8 del 1X 50X E
• dH2O = 400ul 52ul

un amplificatore di 50 X E per il litro

Aggiunga:

• 0.9 M. Na2 HPO4 127.8 bibasici g
• 0.1M NaH2PO4 g monobasico 13.8

Protocollo: Punti nella preparazione del gel del RNA

1. metta l'agarosi nelle soluzioni.
2. Riscaldi la soluzione preparata in boccetta tessuto-tappata
3. Lasci freddo a 60°C
4. Aggiunga la formaldeide al uguale 0.66M 2.7 ml 4.0 5.3 21.2
5. (aggiunga il bromuro di etidio se state usandolo alla boccetta)
6. Versi il gel (in cappuccio se possibile).
7. Riscaldi 2 ug di RNA a 75°C per 10 min., quindi rapidamente raffreddisi (questo permetterà che il RNA denaturi e rimanga singolo-incagliato).
8. Aggiunga: 2.5 volumi di RNA che denaturano reagente
9. Aggiunga 1/10 di volume della tintura di caricamento ai campioni.
10. Carichi i campioni sui pozzi del gel dell'agarosi.
11. Faccia funzionare il gel (solitamente volt 100V) per le ore 30minutes-2. (RNA del controllo che funziona usando gli indicatori della tintura)

Punte per i gel del RNA

Faccia funzionare sempre un gel dell'agarosi del vostro RNA per valutare la qualità. Contano non soltanto soltanto i risultati UV di spettrofotometria.

* Usi l'acqua trattata DEPC e la cristalleria cotta per tutti i punti. Gli amplificatori devono essere RNAsi liberamente o usare l'acqua purificata Milipore se siete in sbalzi. La RNAsi è dappertutto! Porti i guanti, la cristalleria cotta di uso soltanto, o la plastica vergine. Ossequio di DePC la vostra acqua, amplificatori (tranne Tris). Faccia attenzione molto.

 

Gel D'Analisi guasti del RNA

Se attualmente avete un metodo preferito per il funzionamento del RNA, continui ad usarlo.

Discuta e problemi o domande dell'alberino circa i gel del RNA nella tribuna di protocolli del RNA.

Riferimenti Del Gel del RNA