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Macchia Nordica

Copyright 2007 - Stazione Molecolare

AUDIO Ascolti una spiegazione nordica dettagliata della macchia!

Storia di macchiarsi nordico

Macchiarsi nordico è una tecnica macchiantesi del RNA che è stata sviluppata in 1977 da Alwine ed altri all'università di Stanford (ref:1). È stato chiamato dopo la tecnica del sud della macchia che si macchia per DNA, inventata da Edwin M. Southern in 1975. La macchia occidentale, un metodo per macchiarsi per le proteine è egualmente un gioco sulla macchia del sud che chiama ed è stata chiamata in 1981 (ref:2).

Informazioni di base - Tecnica Nordica Della Macchia

L'analisi nordica malgrado la relativa età nel mondo di alta tecnologia di PCR in tempo reale, delle analisi di protezione della nucleasi (RPAs) e dei microarrays, è ancora lo oro-standard per la rilevazione e la quantificazione dei livelli di mRNA. Ciò è perché l'analisi nordica della macchia permette un confronto diretto dell'abbondanza del RNA del messaggero fra i campioni su una singola membrana.

Nella macchia nordica la differenza principale fra le altre tecniche macchiantesi è che il RNA è il fattore che è rilevato. Inoltre, dato che il RNA singolo-è incagliato solitamente, crea le strutture secondarie complesse che interessano la relativa espansione e quindi denaturando le circostanze sono usati fare funzionare i gel (diverso di del sud).

Il RNA è separato fuori tramite l'elettroforesi del gel del RNA (solitamente elettroforesi del gel dell'agarosi), il trasferimento successivo nella membrana, l'ibridazione con la sonda ed infine la rilevazione.

 

 

Similmente a macchiarsi del sud, le sonde di ibridazione possono essere DNA o RNA nel macchiarsi nordico.

Una variante della procedura conosciuta come la macchia nordica d'inversione (anche se, raramente) è stata usata occasionalmente. In questa procedura, il substrato che l'acido nucleico (che è affisso alla membrana) è una collezione di frammenti isolati del DNA e la sonda è RNA estratto da un tessuto ed identificato radioattivo.

L'uso dei microarrays del DNA che hanno entrato nell'uso molto diffuso verso la fine degli anni 90 e di 2000s iniziale è più analogo della procedura d'inversione, in quanto coinvolgono l'uso dei frammenti isolati del DNA affissi ad un substrato e dell'ibridazione con una sonda fatta da RNA cellulare. Così la procedura d'inversione, benchè originalmente raro, permessa lo studio di un-$$$-UN-TEMPO sull'espressione del gene usando analisi nordica per evolversi nell'espressione del gene che profila, in cui molti (possibilmente tutti) dei geni in un organismo possono avere loro espressione controllata

Applicazioni della macchia nordica

Le macchie nordiche sono state superceded nella maggior parte delle zone tramite PCR in tempo reale ed i metodi microarray. Non è usata spesso per gli scopi clinici o diagnostici.

Il protocollo nordico della macchia e le relative variazioni sono usati tuttavia nella ricerca molecolare di biologia:

• uno oro-standard per lo studio diretto sull'espressione del gene al livello del mRNA (trascrizioni del RNA del messaggero).
• rilevazione del formato della trascrizione di mRNA
• degradazione del RNA di studio
• l'impionbatura del RNA di studio - può rilevare le trascrizioni alternativamente impiombate
• studi il periodo radioattivo del RNA
• studio IRES (luogo ribosomal interno dell'entrata) - rimuovere possibilità di digestione del RNA contro la seconda traduzione del cistron.
• ha usato spesso confermare e controllare i mouse knockout/transgenic (animali)

Svantaggi di macchiarsi nordico

Gli svantaggi di usando macchiarsi nordico includono:

• La radioattività è usata spesso. Ciò impedisce la facilità di effettuazione esso, l'uso e dell'eliminazione. I nuovi metodi di rilevazione non radioattiva sono stati generati permettendo la rilevazione non radioattiva. Veda Per perforare.
• Il processo intero di macchiarsi nordico occorre solitamente molto tempo, dalla preparazione del campione attraverso a rilevazione.
• Se i campioni del RNA sono uniforme degradati un po'da RNases, la qualità dei dati e della quantificazione dell'espressione è abbastanza negativamente affected.
• Il metodo nordico standard della macchia è relativamente meno sensibile che le analisi di protezione della nucleasi e RT-PCR. La sensibilità delle macchie nordiche può essere aumentata con l'uso delle membrane positivo-caricate di nylon, uso di una sonda altamente specifica del antisense.
• La rilevazione con le sonde multiple è un problema. Spesso, le membrane devono essere messe a nudo prima dell'ibridazione e della rilevazione con una seconda sonda. Ciò è un problema poichè le circostanze dure sono richieste per togliere le sonde dalla macchia ed è egualmente che richiede tempo. Inoltre, ci è un limite al tempo che una macchia può essere messa a nudo.

Vantaggi di macchiarsi nordico

I vantaggi delle macchie nordiche includono:

• È un metodo ampiamente accettato e bene considerato
• macchiarsi nordico è un metodo straight-forward
• È usato spesso come una conferma o controllo
• Spesso uno oro-standard
• è un protocollo versatile poichè può permettere l'uso di molti tipi di includere delle sonde (contro PCR in tempo reale): RNA e perfino oligonucleotides trascritti radioattivi e non-radioattivi, in vitro quali gli iniettori.
• Le sequenze con persino l'omologia parziale, diverso di PCR in tempo reale o di altri metodi possono essere usate come le sonde di ibridazione (cioè la sequenza dalla specie differente per analisi di omologia, o persino frammenti genomic può essere usata).

Protocollo Nordico Della Macchia

Come accennato i punti nel macchiarsi nordico includono:

1. Isolamento del RNA
2. Elettroforesi del gel di RNA per la separazione
3. Trasferimento nella membrana (il nylon solitamente positivamente caricato come RNA è caricato negativamente)
4. Cross-linking di RNA alla membrana (solitamente attraverso i mezzi del prodotto chimico o Uv-unire con legami atomici incrociati)
5. Ibridazione
6. Rilevazione

I materiali hanno avuto bisogno di per il protocollo nordico della macchia

Ricette Dell'Amplificatore

20XSSPE (500 ml)

• NaCl di 3.6M: 105.2 g
• 0. soluzione tampone a base di fosfato pH 7.0 di 2M: 100mL di 1M
• EDTA di 20mM: 20mL di 0.5M

Soluzione tampone a base di fosfato pH7.0 (500ml)

• NaH2PO4 140 ml (monobasici) di 1M
• Na2H2PO4 360 ml (bibasici) di 1M
• il pH a 7.0 dopo entrambi è aggiunto

Amplificatore di ibridazione = HB (100mls)

• 5X SSPE: 25mls 20X
• 2% SDS: 20 mls 10%

 

* * Di destra prima di utilizzare aggiunga liberamente il RNA del lievito 5000ug del DNA della RNAsi denaturato 1000ug CT (calore a 95o affinchè 3 minuti denaturino)

 

LAVATA: 2X SSPE + 0.1% SDS (500 mls) 50 mls dei mls 20X 5 10% SDS = 0.1% SDS

Amplificatore corrente per il gel del RNA (1L)

• 100 MOPS dei mls 10X
• 52. 6 mls di formaldeide
• 847. 4 mls H20

Gel del RNA (70ml)

• 0.84 agarosi di g
• 7 MOPS dei mls 10x
• 58.38 mls H2O
• Metta il gel in soluzione dal heating. Lasci il gel freddo a 60°C, allora aggiunga la formaldeide ai uguali 0.66M -- 3.78 mls
• Versi il gel in cappuccio del vapore se possibile

Campioni del RNA per la macchia nordica

Veda l'isolamento e la purificazione del RNA

Gel del RNA

Dopo l'isolamento del RNA, il RNA deve essere separato fuori su un gel (solitamente agarosi).

veda i gel del RNA

Trasferimento nordico della macchia nel protocollo di nylon della membrana

Dopo il funzionamento del gel del RNA, lavi il gel con acqua distillata messa su posiblotter.

Gli strati dall'alto al basso sono:

• spugna
• 3-4 taglio delle carte da Whatman al formato (entrambi suddetti alti dovrebbero essere impregnati in 10X SSPE ma non gocciolare)
• mascherina del gel.
• Nota: Si assicurano le sovvrapposizioni del gel la mascherina in moda da poterla sigillare esso la membrana con la riga della parte superiore del gel ed il giusto angolo superiore abbia contrassegnato 3 parti della plastica dura di carta 3M un po'più grande con i fori

Il morsetto sopra e si assicura che ci è una buona guarnizione. Usi 75-80 millimetri Hg di pressione per 1 ora o più.

Macchi la membrana asciutta

Membrane Di nylon Di Cross-linking - Protocollo Nordico Della Macchia

• Tagli l'involucro superiore del giusto angolo in involucro di saran.
• UV irradiisi con il lato del RNA giù per 2.5 minuti.
• Lavisi per una coppia dei minuti nella soluzione calda di 2X SSPE/0.1% SDS (soluzione di microonda per 30-45 secondi ad potenza di 50%.
• Ventili asciutto

Pre ibridazione per la macchia nordica

1. Pre ibridi per 6 ore-durante la notte
2. Regoli il forno 65°C all'amplificatore di calore HB per mettere lo SDS in soluzione
3. Rotoli in su la membrana all'interno della parte della maglia e metta in hybridizaton tube(2X SSPE/0.1%SDS)
4. Controlli per vedere se ci sono bolle di aria
5. Metta il tubo in forno equilibrato con un altro tubo dal lato opposto

Sonda identificante per macchiarsi nordico

1. Metta 25ng della sonda in un volume totale di 11uL con ddH2O
2. Denaturi @ 95°C 3 minuti. Ciò deve ottenere alla sonda singolo incagliato e rimuovere la struttura secondaria che impedirebbe l'ibridazione efficiente.
3. Rapidamente raffreddisi su ghiaccio bagnato. Ciò deve mantenere singolo incagliato della sonda, esente dalla struttura secondaria e non concedere reannealing (o riformare delle strutture secondarie).
4. Aggiunga 4ul il totale radioattivo (Boehringer Mannheim) 5ul dell'alfa su principale P-32 dCTP 3000uCi/mmole 20ul
5. Incubi 10-15 37°C minimi
6. Aggiunga 28uL di 1X TE, EDTA di 2ul 0.5M, a reazione 20ul.
7. Pre-fili la colonna di G-25 il Sephadex per 1 minuto.
8. Aggiunga il campione 50ul alla colonna e fili per 2.5 minuti nella centrifuga clinica. Ciò deve purificare la sonda via dall'etichetta.
9. Del tiro colonna via.
10. Mescoli in un nuovo RNA del lievito del tubo 100ug CT-DNA 50ug in un tubo 0.5mL.
11. Denaturi 95° 3 minuti
12. Aggiunga alla miscela ibrida del tubo, ibridi a 65°C per 20-36 ore

Invii il protocollo di ibridazione per macchiarsi nordico

Ibridi per 36-48 ore allora si lavano.

1. Riscaldi calore di 2X SSPE/0.1% LO SDS (lavata) fino a 65° C (microonda o bagno d'acqua di uso per scaldare soluzione)
2. Elimini il tubo e versi il liquido nel contenitore caldo degli effluenti radioattivi.
3. La risciacquatura con lavata 10ml fa due volte questa e versa lo spreco fuori.
4. Messo in 40 - 50 mls di lavata e della scossa vigoursly.
5. Messo in forno di ibridazione per la rotazione minima 20.
6. Versisi giù il dispersore
7. Un altri 40-50mls e scossa in forno.
8. Versisi fuori al contenitore di rifiuti (dispersore se non caldo o tossico) e che assicurisi che non fa caldo più ed allora elimina la membrana.
9. Lavisi sull'agitatore con 0.2XSSPE con 0.1% SDS al RT per 15 minuti.
10. Ventili asciutto
11. Denunzia

 

Punte per la macchia nordica

Se attualmente avete un metodo preferito per l'isolamento del RNA, continui ad usarlo.

Faccia funzionare sempre un gel dell'agarosi del vostro RNA per valutare la qualità. Conti non soltanto sui risultati di spettrofotometria.

* Usi l'acqua trattata DEPC e la cristalleria cotta. Questa soluzione, assolutamente, positivamente deve essere RNAsi liberamente. La RNAsi è dappertutto! Porti i guanti, la cristalleria cotta di uso soltanto, o la plastica vergine. Ossequio di DePC la vostra acqua, amplificatori (tranne Tris). Faccia attenzione molto.

 

Macchie Nordiche D'Analisi guasti

Se attualmente avete un metodo preferito per l'isolamento del RNA, continui ad usarlo.

 

Discuta ed invii le domande circa questo nella tribuna nordica della macchia.

Riferimenti Nordici Della Macchia

1. Alwine JC, Kemp DJ, GR Rigido (1977). "il metodo per rilevazione di RNAs specifico nell'agarosi si gelifica dal trasferimento in diazobenzyloxymethyl-carta e l'ibridazione con DNA sonda". Proc. Nazionale. Acad. Sci. Gli S.U.A.. 74 (12): 5350-4.
2. W. Neal Burnette (Aprile Del 1981). "'macchiarsi occidentale ': il trasferimento elettroforetico delle proteine dai gel di poliacrilammide del solfato — dodecilico di sodio in nitrocellulosa invariata e della rilevazione radiografica con l'anticorpo e radioiodinated la proteina A ". Biochimica Anale 112 (2): 195-203.