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PCR In tempo reale

PCR in tempo reale e quantitativo

Introduzione a PCR in tempo reale

PCR in tempo reale è un tipo di PCR quantitativo che misura la quantità di DNA o di mRNA in un campione, da una popolazione delle cellule (coltura delle cellule o del tessuto), o recentemente anche da una cellula. Il tempo reale è usato comunemente per determinare l'espressione del mRNA del gene e la relativa espressione livella (numero della copia di mRNA) durante determinati stati (come trattare le cellule con una droga).  PCR in tempo reale può essere usato per confrontare i campioni normali (di controllo) ai campioni di malattia, danti un'idea quanto ai cambiamenti di espressione che si presentano con la patogenesi.  PCR in tempo reale dovuto la relativa sensibilità egualmente è usato nella rilevazione degli agenti patogeni nell'anima quali i virus.

Lo sviluppo di PCR quantitativo in tempo reale ha eliminato la variabilità connessa tradizionalmente con PCR quantitativo, così concedere
quantificazione sistematica e certa dei prodotti di PCR.

Indice

Introduzione a PCR in tempo reale

PCR In tempo reale: Vantaggi di PCR in tempo reale

Storia di PCR in tempo reale

Sistemi in tempo reale di PCR disponibili

Protocolli In tempo reale di PCR

Meccanismo di PCR in tempo reale

PCR In tempo reale: Vantaggi di PCR in tempo reale

Ogni tipo expressess delle cellule un insieme delle molecole di mRNA, conosciuto come un transcriptome.  In risposta agli stimoli, le cellule possono in su-regolare o giù-regolare i fattori quali gli enzimi della proteina all'interno della cellula regolando i livelli di mRNA di questi fattori.  i livelli di mRNA non sono correlati sempre con i livelli della proteina in modo da una certa attenzione è necessaria, comunque i livelli di mRNA corrispondono generalmente senza bloccare ai livelli della proteina.  La misurazione dei livelli di mRNA di determinati fattori all'interno di una cellula che usando il pcr in tempo reale è un metodo che darà gli indizii quanto agli importi di questi fattori o proteine.

Tradizionalmente, i livelli di mRNA all'interno della cellula sono stati misurati usando macchiarsi nordico.  Questa tecnica è considerare come uno oro-standard nella misura dei livelli del gene expression/mRNA mentre usa la sonda radioattiva per identificare il RNA, che allora è misurato usando una scintillazione contro dando le letture molto esatte. Macchiarsi nordico anche se molto esatto ha presentato parecchi svantaggi compreso l'uso di radioattività. Macchiarsi nordico ha richiesto la misura esatta del mRNA ed il RNA totale dalle cellule ha estratto per confrontare i campioni. Ciò era un problema perché anche se i metodi di rilevazione erano molto esatti, l'errore potrebbe essere introdotto macchiarsi nordico (o in RNA dot/slot che si macchia) con le differenze nei livelli totali di RNA/mRNA fra i campioni (trattamenti delle cellule dello IE, tessuti differenti, animali differenti, ecc.).  Egualmente ha richiesto gli importi di RNA relativamente grandi che hanno richiesto tantissime cellule. Recentemente, la quantificazione del gene di mRNA o i metodi in tempo reale del pcr è stato migliorato ed è più facili da effettuare e non richiede l'uso di radioattività.  I ricercatori hanno spesso soltanto accesso ai piccoli importi delle cellule particolarmente nei campi di ricerca della cellula formativa e di ricerca della pila ed il pcr in tempo reale ha permesso di misurare i livelli di mRNA da uniforme molto un piccolo numero di cellule ed ultimamente persino di celluli.  Tuttavia, questa sensibilità estrema dei metodi in tempo reale del pcr lo rende vitale di proteggere i suoi campioni da contaminazione, che condurrebbe ai risultati falsi. I metodi ed i sistemi in tempo reale correnti del pcr egualmente non richiedono la misura delle concentrazioni del campione del DNA o di mRNA prima che il pcr in tempo reale sia condotto.

Storia di PCR in tempo reale

Higuchi et al.1,2 hanno aperto la strada all'analisi della cinetica di PCR costruendo un sistema che rileva i prodotti di PCR As
si accumulano. Questo “sistema” in tempo reale include il bromuro di etidio di intercalator in ogni reazione di amplificazione,
un cycler termico adattato per irradiare i campioni con luce ultravioletta e rilevazione di fluorescenza risultante
con una macchina fotografica raffreddata comandata da calcolatore del CCD. L'amplificazione produce gli importi aumentanti di double-stranded
DNA, che lega il bromuro di etidio, con conseguente aumento nella fluorescenza. Tracciando l'aumento nella fluorescenza
contro il numero del ciclo, il sistema produce i diagrammi di amplificazione che forniscono un'immagine più completa del
PCR elaborano che l'accumulazione analizzante del prodotto dopo un numero fisso di cicli.

Luoghi esterni: veda PCR in tempo reale a PCR in tempo reale Info!

Riferimenti per PCR in tempo reale

1. Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, S. del P. e Griffith, R. 1992. Amplificazione e rilevazione simultanee delle sequenze specifiche del DNA.
Biotecnologia 10:413–417.

2. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G. e Watson, R. 1993. PCR Cinetico: Controllo in tempo reale delle reazioni di amplificazione del DNA.
Biotecnologia 11:1026–1030.

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