Macchia occidentale

Ora impari che tutto altrimenti là è circa le macchie occidentali!

- Campione Prepartation

- Fare l'elettrolisi buffer

- Anticorpo

- Fare l'elettrolisi le celle

- Preparazione del gel

- Gel funzionante

- Trasferimento del gel

- Comandi

- Macchia occidentale

- Lettura

- Analisi ed interpretazione

Se avete le celle Non-aderenti (quali le righe a cellula T o i globuli periferici) o celle aderenti (quali le celle del fibroblasto o le celle del COS), dovete rimuovere le proteine estranee dai media. Per le celle non-aderenti potete appallottolarli delicatamente con centrifugazione ed allora lavare la pallina con PBS. Per le celle aderenti, la lavata semplice la boccetta o il piatto con PBS prima della macchia occidentale.

L'analisi occidentale della macchia esamina le proteine ed in modo da vogliamo le proteine essere versione dalle celle ed anche impedire le proteine essere tagliato dalle proteasi. Abbiamo bisogno di questi alla macchia occidentale:

- per mantenere le cose fredde! 4C su ghiaccio durante la lisi delle cellule per macchiare occidentale

- usi il detersivo per rompere in su le membrane delle celle per rilasciare le proteine

- Buffer

- Inibitori (sia inibitori di proteasi che inibitori della fosfatasi se facciamo la macchia occidentale per le fosfoproteine)

Detersivo - fare l'elettrolisi le celle per la macchia occidentale

Lo SDS e RIPA sono detersivi che sono usati per solubilizzare le proteine per l'analisi successiva usando macchiare occidentale. Ciò è richiesta altretante proteine è all'interno della cella o delle membrane interne individuate delle cellule, in modo da dobbiamo rilasciare queste proteine per potere a immunoblot per loro.

Dovreste selezionare un anticorpo per usare per la macchia occidentale. Solitamente gli anticorpi monoclonali del mouse o gli anticorpi policlonali del coniglio sono usati.

Potete usare o un anticorpo senza alcuni gruppi aggiunti, o usi un anticorpo che è coniugato a biotina. Questi anticorpi non richiedono

Policlonale contro gli anticorpi monoclonali per la macchia occidentale

Gli anticorpi monoclonali sono solitamente migliori per macchiare occidentale dovuto:

- migliore rapporto di segnale/disturbo (priorità bassa più bassa nella macchia occidentale)

- la loro più alta specificità (ottenete meno proteine o Ig di contaminazione)

- risultati generali del pulitore sulla pellicola macchiante occidentale (fasce meno non specifiche rilevate)

Gli anticorpi policlonali sono adatti più meglio per immunoprecipitazione:

- riconoscono più epitopi

- abbia più alta avidità

Le PUNTE prima di voi fanno l'elettrolisi per macchiare occidentale:

Se stiate andando alla macchia occidentale per la massa della proteina (IE una proteina che non è fosforilata):

- potete fare l'elettrolisi nei più grandi volumi (che mantengono il resto per macchiare per altre proteine)

Se stiate andando alla macchia occidentale una fosfoproteina (o proteina fosforilata) è importante fare quanto segue:

- selo assicuri inibitori della fosfatasi di uso (quale vanadate perché le fosfatasi elimineranno i fosfati dalle vostre proteine! )

- egualmente faccia l'elettrolisi le celle nel più piccolo volume possibile (IE fa l'elettrolisi nel buffer di caricamento dell'UL 100, questo è fatto perché potete caricare la maggior parte delle celle che avete fatto l'elettrolisi. Ciò è per quanto il segnale sia importante abbastanza debole quando macchiare occidentale per le fosfoproteine.)

Se stiate esaminando le interazioni della proteina-proteina:

- non usi lo SDS come dissocia le interazioni della proteina-proteina e le proteine sono denaturate così (particolarmente dopo l'ebollizione)

- per le interazioni macchianti occidentali della proteina-proteina, interazioni natali dello IE dovete usare un detersivo di meno-rigoroso tali RIPA.

Fare l'elettrolisi:

- può essere fatto direttamente sul piatto o sul piatto

- appallottoli le celle

- Mantenga su ghiaccio e sul freddo - utilizzi una benna di ghiaccio

- Regola empirica affinchè quanto buffer di lisi usi è: 10^5 celle/UL del buffer di lisi

- raccolga in tubi del eppendorf e contrassegni (mantenga questi su ghiaccio)

Misuri la proteina totale prima dell'analisi occidentale della macchia:

- questo permette l'analisi più quantitativa se volete confrontare i termini di trattamento nell'analisi occidentale della macchia

- i kit commerciali sono disponibili quale un'analisi di Bradford per la misurazione della proteina totale (da Bio--Rad)

- 0.1% di SDS o maggior può interferire con la misura della proteina

Denaturi i campioni della proteina:

- aggiunga il buffer del campione di caricamento della proteina ad un'aliquota del lysate delle cellule - contiene la tintura (anche vedi l'espansione su un gel, 2% SDS)

- aggiunga l'agente riduttore del bisolfuro come beta - mercaptoetanolo

- Punto di ebollizione nel blocchetto del riscaldamento o del bagno d'acqua (temperature più insufficienti come metà di - 90 gradi fanno diminuire l'aggregazione della proteina).

- Colpisca un foro in protezione di ogni tubo per evitare che schioccano

I gel di SDS-PAGE sono tabelle del gel che sono usate per separare le proteine dal formato in presenza della corrente elettrica. I gel bassi di percentuale separano le più grandi proteine mentre gli più alti gel di percentuale separano più meglio le più piccole proteine. Il problema è che tutte le proteine hanno incaricato collegato di loro ed in una corrente elettrica questa potrebbe causare i problemi. Ciò è risolta tramite l'aggiunta di SDS ai campioni della proteina. Lo SDS lega alle proteine ogni pochi amminoacidi e neutralizza le differenze della carica che le proteine hanno. Ciò permette che le proteine siano separate dal formato e non dalla carica.

- secondo quanto proteina vorrete caricare per macchiare occidentale, dovreste utilizzare i piccoli pettini o i più grandi pettini.

- la percentuale dell'acrilamide è importante. L'acrilamide di solitamente 10% è usata.

- Un gel di risoluzione è usato alla parte inferiore con un pH di 8.8

- Un gel d'impilamento (4-5%) il pH 6.8 è usato per imballare le proteine dentro insieme dopo il carico

- La polimerizzazione dei gel è aumentata dai catalizzatori APS e TEMED che accelerano la reazione di polimerizzazione (formazione e solidificazione) del gel di poliacrilammide.

- Carichi con attenzione ogni campione ed impedire lentamente il campione che cola dal vicolo.

- Carichi ogni vicolo ed utilizzi il buffer del campione in ciascuno (per impedire le differenze dentro).

1. Centrifughi i campioni per sec 10 dopo l'ebollizione.
2. Carichi il campione in ogni vicolo
3. Carichi il riferimento di Mw
4. Esegua il gel a 100V (tensione costante) o persino migliori a 40 mA (corrente costante). Guardi l'indicatore/scaletta della proteina o tinga la parte anteriore affinchè quando arrestino il gel. Le elasticità correnti costanti migliorano e più forti risultati se avete il tempo.

- vigilanza per le bolle fra vetro e sotto il gel - questo significa che sta funzionando

- vigilanza per espansione della proteina (dovrebbe andare giù) - se non avete passato i cavi e potete perdere tutti i vostri campioni!

- Inizialmente funzioni lentamente attraverso il gel d'impilamento (~ 50 volt), questo dà le fasce più taglienti.

- Non funzioni durante la notte

- Non surriscaldi il gel (questo induce il gel a perdere la rigidità, conducendo resoloving dei poveri ed alle fasce male formate confuse)

Selezioni il tipo della membrana:

Può usare l'uno o l'altro:

- Membrana di PVDF per le macchie occidentali

- Membrana della nitrocellulosa per le macchie occidentali

- Membrana di nylon (ora utilizzata raramente - può strappare)

Punte per il trasferimento alla membrana occidentale:

- Guanti di usura sempre! Utilizzi il forcipe

- Minimizzi il contatto/forcipe alla membrana

Ordine di trasferimento Bio--RAD:

(-)
spugna sul nero
carta da filtro
nitrocellulosa del gel
carta da filtro
spugna
(+)

Trasferimento:

- Mantenga freddo in 4C

- Trasferimento durante la notte a 35 V

- Può trasferire rapidamente in 1 ora all'più alta V

Il blocco delle membrane permette che eleviate del segnale: rapporto di disturbo

- guanti di usura

- Blocco con 5% Blotto (latte in polvere senza grassi - polvere) o 1 - 5% BSA (albumina del siero di bue) per le proteine fosforilate.

- Il buffer è TBST

Lavando dopo il blocco

- lavare dopo il blocco dei punti non è critico, poichè blocchetto della gente spesso durante le incubazioni primarie dell'anticorpo.

- il lavaggio è fatto solitamente con il buffer di TBST. Può essere fatto rapidamente con un grande volume di TBST.

Incubazione con l'anticorpo primario

- mouse, coniglio o l'altra specie

- solitamente 1: diluzione 1000 con TBST

- se l'alta priorità bassa/molte fasce non specifiche è un problema, le incubazioni possono essere fatte con 5% BSA o latte.

Lavando dopo l'anticorpo primario

- non così critico

- può lavare rapidamente con i grandi volumi di TBST

Incubazione dell'anticorpo secondario

- 1 solitamente diluito: 10, 000 con TBST

- anti-mouse, anti-coniglio, o l'altro anticorpo coniugato con l'enzima di HRP per rilevazione

Lavando dopo l'anticorpo secondario

- CRITICO

- Lavata 5 X per 5 minuti con TBST.

- Se realmente dovete scorrere veloce, lavare almeno 3 volte con i più grandi volumi di TBST.

Analizzando per i risultati

- il ECL (chemiluminescenza aumentata) è usato solitamente

- la pellicola è esposta e sviluppata. L'esposizione per 10 secondi è abbastanza solitamente per proteina totale. Le fosfoproteine possono richiedere le 2 - 20 esposizioni minute.

- la pellicola è solitamente XOMAT o simile pellicola “veloce„

WB - macchia occidentale

IB - immunoblot (un altro termine per macchiare occidentale)

SDS - Solfato dodecilico di sodio (un detersivo utilizzato in molte soluzioni macchianti occidentali)

PAGINA - elettroforesi del gel di Polyacrilamide

Ab - Anticorpo (anticorpi sono usati per rilevare la vostra proteina di interesse)

HRP - Perossidasi del rafano

Luminol - substrato che HRP si fende per causare a formazione chiara

ECL - Chemiluminescenza aumentata (soluzione occidentale della macchia da cui aumenta la formazione chiara a partire HRP + Luminol)

kD/kDa - kilodalton (la maggior parte della media delle proteine fra il kDa 30 - 80)

RAM - anti-mouse Ig del coniglio

Ig - immunoglobulina (un isotipo dell'anticorpo)

NP-40 - Nonidet P-40

PMSF - fluoruro di phenylmethylsulfonyl

BSA - Albumina del siero di bue

NFDM - Latte in polvere senza grassi