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Macchia Occidentale

AUDIO: Ascolti una spiegazione occidentale dettagliata della macchia! Cortesia: Istituto di ricerca Umano Nazionale Del Genome.

Definizione Occidentale Della Macchia: Macchiarsi occidentale è una tecnica usata per identificare ed individuare le proteine basate sulla loro capacità di legarsi agli anticorpi specifici.

   L'analisi occidentale della macchia può rilevare la vostra proteina di interesse da una miscela di tantissime proteine.  Macchiarsi occidentale può fornirvi le informazioni sul formato della vostra proteina (con il confronto ad un indicatore o una scaletta di formato in kDa) ed egualmente vi fornisce le informazioni sull'espressione della proteina (con il confronto ad un controllo quali il campione non trattato o un altro tipo o tessuto delle cellule). 

Sommario: La macchia occidentale vi fornisce le informazioni sul:

Formato della vostra proteina

Quantità di espressione di vostra proteina

L'analisi occidentale della macchia può analizzare tutto il campione della proteina se dalle cellule o dai tessuti, ma anche può analizzare le proteine recombinant sintetizzate in vitro. La macchia occidentale dipende dalla qualità dell'anticorpo che usate sondare per la vostra proteina di interesse e quanto specifico è per questa proteina. Gli anticorpi ora sono facilmente disponibili alle sorgenti commerciali e potete comprare uno per la vostra proteina di interesse. Se la vostra proteina è una proteina del romanzo, dovete produrre un anticorpo voi stessi o convincere un'azienda a farvelo per. In questo caso avrete bisogno almeno di piccola quantità di vostra proteina purificata dagli estratti delle cellule o fatta come un recombinant (IE in vitro o in un sistema recombinant di espressione della proteina).   Gli anticorpi specifici alla vostra proteina sono vitali a macchiarsi occidentale poichè possono legarsi specificamente alla vostra proteina di interesse anziché le migliaia delle proteine sulla vostra macchia occidentale!

Figura 1. Particolari dei punti addetti ad ottenere proteina per la macchia occidentale.

  Figura 2. Calcoli dettagliare i punti nella condotta della macchia occidentale.

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Come Macchiarsi Occidentale Funziona?

Veda lo schema 1 qui sotto. Prime cose prime. Ottenga un campione che della proteina desiderate analizzare, quali i campioni delle cellule. Lyse le cellule per liberare i contenuti proteici. Faccia funzionare questi su un gel che separa le proteine in base al formato. Allora trasferisca queste proteine del gel su una membrana usando l'elettricità. Questa membrana può allora essere utilizzata per sondare per le proteine di interesse usando un anticorpo primario.

Che cosa avete bisogno della macchia occidentale:

Un Campione Della Proteina

Un buon anticorpo per rilevare la vostra proteina di interesse

La macchia occidentale conta sull'anticorpo primario per rilevare questa proteina dalle migliaia delle proteine sulla vostra membrana e precedentemente sul vostro gel! (una cellula può contenere 30.000 proteine differenti - e queste stesse proteine possono persino essere alterate dandoli oltre 300.000 proteine differenti!). Usando un anticorpo riconosce il vostro anticorpo primario (un anticorpo secondario) che sviluppate un panino dell'proteina-anticorpo-anticorpo!  L'anticorpo secondario ha un enzima della perossidasi del rafano che converte un substrato di luminol in sostanza liberantesi chiara! Questa luce è rilevata come punto sulla pellicola. A partire da questo punto potete determinare quanta proteina è là riguardante altri punti, o il formato della proteina riguardante un indicatore di formato che è fatto funzionare egualmente sul gel.

Lo schema 2 mostra un gel occidentale di esempio della macchia. Il vicolo 1 è una scaletta dell'indicatore di formato della proteina che mostra i formati conosciuti differenti delle proteine, questo può essere comprato commercialmente ed i formati di tutti i punti sono dati in un opuscolo. Il vicolo 3 è un campione del cancro ed il vicolo 5 è un campione normale. Come potete vedere la proteina in vicolo 3 ha un'più alta espressione che il campione del cancro in vicolo 5, che è interessante. Inoltre, i punti della proteina in vicoli 3 e 5 sono lo stesso formato come il secondo punto nella scaletta di formato dal vicolo 1. Possiamo allora guardare il formato conosciuto della proteina dal nostro opuscolo che abbiamo ricevuto con la scaletta. Allora determiniamo che il formato della proteina sia kDa 80. La nostra proteina di interesse è egualmente kDa 80. Così sappiamo che la macchia occidentale ha funzionato e che la proteina altamente è espressa in un campione del cancro!

Per rilevare la vostra proteina:

Compri un anticorpo contro la vostra sorgente primaria dell'anticorpo

Usi un ECL - kit e pellicola di chemiluminescenza per ottenere i risultati

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Schema 1.                                                                                                                                      Schema 2.

Ora impari che tutto altrimenti là è circa le macchie occidentali!

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Indice, nell'ordine fatto per la macchia occidentale:

Punti nel macchiarsi occidentale:

- preparandosi per la macchia occidentale

- che anticorpo da usare per le macchie occidentali

- lysing le cellule per la macchia occidentale

- Le Informazioni Del Gel di SDS-PAGE

- preparazione del gel di SDS-PAGE per le macchie occidentali

- elettroforesi del gel - fare funzionare il gel

- Tranfer delle proteine alla membrana per macchiarsi occidentale

- Macchia Occidentale

Termini e definizioni usati nell'analisi occidentale della macchia

Ultimi Soggetti Occidentali Della Macchia!

 

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Punti nell'analisi occidentale della macchia:

- Campione Prepartation

- Lysing Amplificatore

- anticorpo

- Lysing Le Cellule

- Preparazione Del Gel

- Gel Funzionante

- trasferimento del gel

- comandi

- Macchia Occidentale

- lettura

- analisi ed interpretazione

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Per preparare i campioni per la macchia occidentale:

Se avete le cellule Non-aderenti (quali le righe della T-cellula o le cellule di anima periferiche) o cellule aderenti (quali le cellule del fibroblasto o le cellule del COS), dovete rimuovere le proteine estranee dai media. Per le cellule non-aderenti potete appallottolarli delicatamente con centrifugazione ed allora lavare la pallina con PBS. Per le cellule aderenti, la lavata semplice la boccetta o il piatto con PBS prima della macchia occidentale.

 

L'analisi occidentale della macchia esamina le proteine ed in modo da desideriamo le proteine essere versione dalle cellule ed anche impedire le proteine essere tagliato dalle proteasi. Abbiamo bisogno di questi alla macchia occidentale:

- per mantenere le cose fredde! 4C su ghiaccio durante il lysis delle cellule per macchiarsi occidentale

- usi il detersivo per rompere in su le membrane delle cellule per liberare le proteine

- amplificatore

- inibitori (sia inibitori della proteasi che inibitori della fosfatasi se faremo la macchia occidentale per le fosfoproteine)

 

Detersivo - Lysing Le Cellule Per La Macchia Occidentale

Lo SDS e RIPA sono detersivi che sono usati per solubilizzare le proteine per analisi successiva usando macchiarsi occidentale. Ciò è richiesta altretante proteine è all'interno della cellula o delle membrane interne individuate delle cellule, in modo da dobbiamo liberare queste proteine per potere a immunoblot per loro.

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Quale anticorpo dovrei usare per macchiarsi occidentale?

Dovreste selezionare un anticorpo per usare per la macchia occidentale. Solitamente gli anticorpi monoclonal del mouse o gli anticorpi di polyclonal del coniglio sono usati.

Potete usare o un anticorpo senza alcuni gruppi aggiunti, o usi un anticorpo che si coniuga a biotina. Questi anticorpi non richiedono

 

Polyclonal contro gli anticorpi monoclonal per la macchia occidentale

Gli anticorpi monoclonal sono solitamente migliori per macchiarsi occidentale dovuto:

- rapporto migliore di segnale/disturbo (priorità bassa più bassa nella macchia occidentale)

- la loro più alta specificità (ottenete meno proteine o Ig di contaminazione)

- risultati generali del pulitore sulla pellicola macchiantesi occidentale (meno non-specifico lega rilevato)

 

Gli anticorpi di Polyclonal sono adatti più meglio per immunoprecipitazione:

- riconoscono più epitopes

- abbia più alto avidity

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Lysing le cellule per la macchia occidentale:

Le PUNTE prima di voi lyse per macchiarsi occidentale:

Se state andando alla macchia occidentale per la massa della proteina (IE una proteina che non è fosforilata):

- potete lyse nei più grandi volumi (che mantengono il resto per macchiarsi per altre proteine)

 

Se state andando alla macchia occidentale una fosfoproteina (o proteina fosforilata) è importante fare quanto segue:

- vi assicurate inibitori della fosfatasi di uso (quale vanadate perché le fosfatasi elimineranno i fosfati dalle vostre proteine! )

- egualmente lyse le cellule nel più piccolo volume possibile (IE lyse nell'amplificatore di caricamento dell'UL 100, questo è fatto perché potete caricare la maggior parte delle cellule che lysed. Ciò è per quanto il segnale sia importante abbastanza debole quando macchiarsi occidentale per le fosfoproteine.)

 

Se state guardando le interazioni della proteina-proteina:

- non usi lo SDS come dissocia le interazioni della proteina-proteina e le proteine sono denaturate così (particolarmente dopo l'ebollizione)

- per le interazioni macchiantesi occidentali della proteina-proteina, interazioni natali dello IE dovete usare un detersivo di meno-rigoroso tali RIPA.

 

Lysing:

- può essere fatto direttamente sulla piastra o sul piatto

- appallottoli le cellule

- mantenga su ghiaccio e su freddo - utilizzi una benna di ghiaccio

- regola pratica affinchè quanto amplificatore di lysis usi è: cellule 10^5/uL dell'amplificatore di lysis

- raccolga nei tubi e nell'etichetta del eppendorf (mantenga questi su ghiaccio)

 

Misuri la proteina totale prima di analisi occidentale della macchia:

- questo permette l'analisi più quantitativa se desiderate confrontare i termini di trattamento nell'analisi occidentale della macchia

- i kit commerciali sono disponibili quale un'analisi de Bradford per la misurazione della proteina totale (da Bio--Rad)

- 0.1% di SDS o della latta più grande interferiscono con la misura della proteina

 

Denaturi I Campioni Della Proteina:

- aggiunga l'amplificatore del campione di caricamento della proteina ad un'aliquota del lysate delle cellule - contiene la tintura (anche veda l'espansione su un gel, 2% SDS)

- aggiunga l'agente riduttore del bisolfuro come beta - mercaptoetanolo

- boil nel blocchetto del heating o del bagno d'acqua (temperature più insufficienti come metà di - 90 gradi fanno diminuire l'aggregazione della proteina).

- colpisca un foro in protezione di ogni tubo per evitare che schioccano

 

Le informazioni del gel di SDS-PAGE per macchiarsi occidentale

I gel di SDS-PAGE sono tabelle del gel che sono usate per separare le proteine dal formato in presenza della corrente elettrica. I gel bassi di percentuale separano le più grandi proteine mentre gli più alti gel di percentuale separano più meglio le più piccole proteine. Il problema è che tutte le proteine hanno caricato collegato di loro ed in una corrente elettrica questa potrebbe causare i problemi. Ciò è risolta tramite l'aggiunta di SDS ai campioni della proteina. Lo SDS lega alle proteine ogni pochi amminoacidi e neutralizza le differenze della carica che le proteine hanno. Ciò permette che le proteine siano separate dal formato e non dalla carica.

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Preparazione del gel di SDS-PAGE per la macchia occidentale

- secondo quanto proteina desidererete caricare per macchiarsi occidentale, dovreste utilizzare i piccoli pettini o i più grandi pettini.

- la percentuale dell'acrilamide è importante. L'acrilamide di solitamente 10% è usata.

- un gel di risoluzione è usato alla parte inferiore con un pH di 8.8

- un gel d'impilamento (4-5%) il pH 6.8 è usato per imballare le proteine dentro insieme dopo il carico

- la polimerizzazione dei gel è aumentata dai catalizzatori APS e TEMED che accelerano la reazione di polimerizzazione (formazione e solidificazione) del gel di poliacrilammide.

- carichi con attenzione ogni campione ed impedire lentamente il campione che fuoriesce dal vicolo.

- carichi ogni vicolo ed usi l'amplificatore del campione in ciascuno (per impedire le differenze dentro).

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Gelifichi L'Elettroforesi

1. Centrifughi i campioni per 10 sec dopo l'ebollizione.
2. Carichi il campione in ogni vicolo
3. Carichi il riferimento di Mw
4. Faccia funzionare il gel a 100V (tensione costante) o persino migliori a 40 mA (corrente costante). Guardi la proteina marker/ladder o tinga la parte anteriore affinchè quando arrestino il gel. La corrente costante fornisce risultati migliori e più marcati se avete il tempo.

- vigilanza per le bolle fra vetro e sotto il gel - questo significa che sta funzionando

- vigilanza per espansione della proteina (dovrebbe andare giù) - se non avete passato i cavi e potete perdere tutti i vostri campioni!

- inizialmente funzioni lentamente attraverso il gel d'impilamento (~ 50 volt), questo dà le fasce più taglienti.

- non funzioni durante la notte

- non surriscaldi il gel (questo induce il gel a perdere la rigidità, conducendo resoloving del povero ed alle fasce male formate blurry)

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Tranfer delle proteine alla membrana per macchiarsi occidentale

Selezioni Il Tipo Della Membrana:

Può usare uno:

- membrana di PVDF per le macchie occidentali

- membrana della nitrocellulosa per le macchie occidentali

- membrana di nylon (ora utilizzata raramente - può strapparsi)

 

Punte per Transfering alla membrana occidentale:

- guanti di usura sempre! Utilizzi il forcipe

- minimizzi touching/forceps alla membrana

 

Ordine di trasferimento Bio--Rad:

(-)
spugna su nero
carta da filtro
nitrocellulosa del gel
carta da filtro
spugna
(+)

Trasferimento :

- mantenga freddo in 4C

- trasferimento durante la notte a 35 V

- può trasferire rapidamente in 1 ora all'più alta V

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Macchia Occidentale

Ostruendo delle membrane permette che eleviate il rapporto di signal:noise

- guanti di usura

- blocco con 5% Blotto (latte in polvere senza grassi - polvere) o 1 - 5% BSA (albumina del siero di bue) per le proteine fosforilate.

- l'amplificatore è TBST

Lavandosi Dopo Avere ostruito

- lavarsi dopo avere ostruito i punti non è critico, poichè blocchetto della gente spesso durante le incubazioni primarie dell'anticorpo.

- il lavaggio è fatto solitamente con l'amplificatore di TBST. Può essere fatto rapidamente con un grande volume di TBST.

Incubazione con l'anticorpo primario

- mouse, coniglio o l'altra specie

- solitamente 1: diluzione 1000 con TBST

- se le alte fasce di background/many non-specifico è un problema, le incubazioni possono essere fatte con 5% BSA o latte.

Lavandosi dopo l'anticorpo primario

- non così critico

- può lavarsi rapidamente con i grandi volumi di TBST

Incubazione dell'anticorpo secondario

- 1 solitamente diluito: 10. 000 con TBST

- anti-mouse, anti-coniglio, o l'altro anticorpo coniugato con l'enzima di HRP per rilevazione

Lavandosi Dopo L'Anticorpo Secondario

- CRITICO

- lavata 5 X per 5 minuti con TBST.

- se realmente dovete scorrere veloce, lavare almeno 3 volte con i più grandi volumi di TBST.

Analizzando per i risultati

- il ECL (chemiluminescenza aumentata) è usato solitamente

- la pellicola è esposta e sviluppata. L'esposizione per 10 secondi è abbastanza solitamente per proteina totale. Le fosfoproteine possono richiedere 2 - 20 esposizioni minute.

- la pellicola è solitamente XOMAT o pellicola 'veloce 'simile

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Veda La Macchia Occidentale D'Analisi guasti

Termini usati nel macchiarsi occidentale:

WB - macchia occidentale

IB - immunoblot (un altro termine per macchiarsi occidentale)

Sds - solfato dodecilico di sodio (un detersivo usato in molte soluzioni macchiantesi occidentali)

PAGINA - Elettroforesi Del Gel Di Polyacrilamide

Ab - anticorpo (anticorpi sono usati per rilevare la vostra proteina di interesse)

HRP - Perossidasi Del Rafano

Luminol - substrato che HRP si fende per causare a formazione chiara

Ecl - chemiluminescenza aumentata (soluzione occidentale della macchia da cui aumenta la formazione chiara a partire HRP + Luminol)

kD/kDa - kilodalton (la maggior parte della media delle proteine fra il kDa 30 - 80)

RAM - anti-mouse Ig del coniglio

Isotype dell'anticorpo di Immunoglobulin(an - di Ig)

NP-40 - Nonidet P-40

PMSF - fluoruro di phenylmethylsulfonyl

BSA - Albumina Del Siero Di Bue

NFDM - latte in polvere senza grassi

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