Macchie occidentali d'eliminazione dell'errore

- Trasferimento difficile dovuto le bolle di aria durante il trasferimento nella membrana

- pellicola sporca quando aggiungono allo sviluppatore

- i rulli di sviluppatore sono sporchi

Soluzione ai punti sulla pellicola:

- utilizzi una pipetta di pasteur come rullo. rotoli la membrana ed il gel prima del trasferimento per rimuovere le bolle. mantenga la membrana ed i materiali bagnati.

- mantenga la pellicola pulita prima dell'aggiunta allo sviluppatore

Problema occidentale d'eliminazione dell'errore delle macchie:

- solitamente dovuto molte fasce non specifiche

- qualità primaria difficile dell'anticorpo o vecchio anticorpo

- non abbastanza ostruendo

- fenditura proteolitica dell'antigene - tutte le fasce supplementari sono Mw più basso che la vostra proteina, (IE la vostra proteina sta rilevando ma è stato degradato)

Soluzioni a troppe fasce sulla macchia occidentale:

- compri un altro anticorpo o sostituisca con lle azione fresche dell'anticorpo

- blocco con il latte senza grassi in polvere di 5% o BSA prima dell'aggiunta primaria. Se già stiate ostruendo, studi la possibilità di ostruire durante le incubazioni primarie e secondarie dell'anticorpo ed anche di aumentare ostruendo il latte o la concentrazione di BSA.

- mantenga tutto su ghiaccio, usi i campioni freschi, memorizzi dentro - 80C ed usi gli inibitori di proteasi quale PMSF

Problema occidentale d'eliminazione dell'errore delle macchie:

- il nero o ogni pellicola scura; la pellicola è stata esposta troppo lungamente

- ostruire era insufficiente; il legame non specifico dell'anticorpo primario e gli anticorpi secondari non sono stati lavati completamente

- il lavaggio era insufficiente

- la pellicola emette luce nello scuro! - diluzioni secondarie o primarie troppo alte

Soluzioni alla pellicola scura:

- denunzia per meno tempo, tempo di esposizione di diminuzione

- aumenti il blocco della durata di incubazione senza grassi del latte in polvere 5% o aumenti la concentrazione.

- anche potete provare ad ostruire con l'intero siero dell'animale ospite con (o prima) l'anticorpo secondario

- aumenti i periodi ed i volumi di lavaggio contribuire a rimuovere tutto il segnale non specifico dovuto il grippaggio debole dell'anticorpo.

- usando un più forte detersivo per lavare - anziché TBST (Tween-20), per usare i più forti detersivi quali NP-40 o SDS che possono fornire una lavata più rigorosa e ridurre la priorità bassa (fa questo soltanto se legate è forte! - lavare anche rimuove una certa vostra fascia di interesse!)

- concentrazione secondaria molto alta primario o persino (nell'anticorpo) - effettui gli esperimenti di ottimizzazione per determinare le diluzioni adeguate dell'anticorpo. diluisca gli anticorpi ulteriori.

Problema occidentale d'eliminazione dell'errore delle macchie:

- dovuto non abbastanza proteina ha caricato sul gel

- l'anticorpo primario è vecchio o non buono

- le fosfoproteine hanno bisogno solitamente dell'incubazione primaria di notte dell'anticorpo

- non abbastanza anticorpo secondario

- sopra-ostruendo

- i reagenti di sviluppo sono difettosi/voi hanno fatto un errore quando le prepara

Soluzioni al segnale basso o al segnale debole:

- carichi più campione della proteina sul gel

- anticorpo primario fresco di prova

- incubi il overnite primario dell'anticorpo per le fosfoproteine a 4 gradi di C (agitatore della cella frigorifera)

- aumenti la concentrazione di proteina (faccia l'elettrolisi i campioni in meno buffer di lisi)

- faccia diminuire la concentrazione di mezzo di bloccaggio

- controlli i reagenti di sviluppo; prepari il ECL ed il re-ECL freschi la membrana

- aumenti la concentrazione o la durata di periodo primario di incubazione dell'anticorpo

- aumenti la concentrazione o la durata di periodo secondario di incubazione dell'anticorpo

- spalmato fasce dovuto il gel caldo

- sfocato delle fasce dovuto tensione

Soluzioni alle fasce sfocate ed alle fasce Un-sharp:

- faccia diminuire la tensione o corrente, funzioni nella cella frigorifera e prepari il nuovo buffer corrente. (il calore induce il gel a perdere la relativa rigidità e la relativa potenza di risoluzione)

- pre-impregni la membrana di trasferimento nella soluzione adatta di trasferimento (determinata dal fornitore della membrana) per la durata richiesta.