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Macchie Occidentali D'Analisi guasti

  La guida molecolare della stazione ai problemi ed alle soluzioni macchiantesi occidentali: Problemi e soluzioni occidentali comuni della macchia per loro!

Seli metta in contatto con prego con le vostre idee se potete aggiungere a questa guida.

 

Che cosa è il vostro problema occidentale della macchia? - Organizzato In ordine alfabetico

Fasce Sfocate

Segnale Basso

La membrana sta emettendo luce nella stanza scura

Alta Priorità bassa

Punti sulla pellicola

Troppe fasce nella macchia occidentale

Segnale Debole

 

 

Problema Occidentale D'Analisi guasti Delle Macchie:

Punti sulla pellicola (fasce di mancanza) :

- Povero trasferimento dovuto le bolle di aria durante il trasferimento nella membrana

- pellicola sporca quando aggiungono allo sviluppatore

- i rulli di sviluppatore sono sporchi

Soluzione ai punti sulla pellicola:

- utilizzi una pipetta di pasteur come rullo del rullo la membrana ed il gel prima del trasferimento per rimuovere la membrana ed i materiali di conservazione delle bolle bagnati.

- mantenga la pellicola pulita prima della aggiunta allo sviluppatore

 

Problema Occidentale D'Analisi guasti Delle Macchie:

Troppe fasce nella macchia occidentale:

- solitamente dovuto molte fasce di non-specifico

- povera qualità primaria dell'anticorpo o vecchio anticorpo

- non abbastanza ostruendo

- fenditura proteolitica dell'antigene - tutte le fasce supplementari sono Mw più basso che la vostra proteina, (IE la vostra proteina sta rilevando ma è stato degradato)

Soluzioni a troppe fasce sulla macchia occidentale:

- compri un altro anticorpo o sostituisca con lle azione fresche dell'anticorpo

- blocco con il latte senza grassi in polvere di 5% o BSA prima della aggiunta primaria. Se già state ostruendo, studii la possibilità di ostruire durante le incubazioni primarie e secondarie dell'anticorpo ed anche di aumentare ostruendo il latte o la concentrazione di BSA.

- mantenga tutto su ghiaccio, usi i campioni freschi, memorizzi dentro - 80C ed usi gli inibitori della proteasi quale PMSF

 

Problema Occidentale D'Analisi guasti Delle Macchie:

Alta priorità bassa; rapporto basso di segnale/disturbo sulla macchia occidentale

- nero o ogni pellicola scura; la pellicola era troppo lungo esposto

- ostruire era insufficiente; il legame di non-specifico dell'anticorpo primario e gli anticorpi secondari non sono stati lavati completamente

- il lavaggio era insufficiente

- la pellicola emette luce nell'oscurità! - diluzioni secondarie o primarie troppo alte

Soluzioni alla pellicola scura:

- denunzia per meno tempo, tempo di esposizione di diminuzione

- aumenti ostruire la durata di incubazione a secco senza grassi del latte 5% o aumenti la concentrazione.

- anche potete provare ad ostruire con il siero intero dell'animale ospite con (o prima) l'anticorpo secondario

- aumenti i periodi di lavaggio ed i volumi ad aiuto rimuovono tutto il segnale di non-specifico dovuto il grippaggio debole dell'anticorpo.

- usando un detersivo più forte per lavarsi - anziché TBST (Tween-20), per usare i detersivi più forti quali NP-40 o SDS che possono fornire una lavata più rigorosa e ridurre la priorità bassa (fa questo soltanto se legate è forte! - lavarsi anche rimuove una certa vostra fascia di interesse!)

- concentrazione secondaria molto alta primario o persino (nell'anticorpo) - effettui gli esperimenti di ottimizzazione per determinare le diluzioni adeguate dell'anticorpo diluono gli anticorpi più ulteriormente.

 

Problema Occidentale D'Analisi guasti Delle Macchie:

Segnale basso o segnale debole

- dovuto non abbastanza proteina caricata sul gel

- l'anticorpo primario è vecchio o non buono

- le fosfoproteine hanno bisogno solitamente dell'incubazione primaria di notte dell'anticorpo

- non abbastanza anticorpo secondario

- sopra-ostruendo

- i reagenti di sviluppo sono difettosi/voi hanno fatto un errore quando le prepara

Soluzioni al segnale basso o al segnale debole:

- carichi più campione della proteina sul gel

- anticorpo primario fresco di prova

- incubi il overnite primario dell'anticorpo per le fosfoproteine a 4 gradi di C (agitatore della cella frigorifera)

- aumenti la concentrazione di proteina (lyse i campioni in meno amplificatore di lysis)

- faccia diminuire la concentrazione del mezzo di bloccaggio

- controlli i reagenti di sviluppo; prepari il ECL fresco e re-ECL la membrana

- aumenti la concentrazione o la lunghezza del periodo primario di incubazione dell'anticorpo

- aumenti la concentrazione o la lunghezza del periodo secondario di incubazione dell'anticorpo

 

Fasce sfocate, fasce spalmate, fasce non taglienti

- spalmato fasce dovuto il gel caldo

- sfocato delle fasce dovuto alta tensione

Soluzioni alle fasce sfocate ed alle fasce un-sharp:

- faccia diminuire la tensione o corrente, funzioni nella cella frigorifera e prepari il nuovo amplificatore corrente (calore induce il gel a perdere la relativa rigidità e la relativa potenza di risoluzione)

- pre-impregni la membrana di trasferimento nella soluzione adatta di trasferimento (determinata dal fornitore della membrana) per la durata richiesta.