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Purificazione Della Proteina

Stazione Molecolare Del Copyright 2006

La purificazione della proteina è vitale nella descrizione della vostra proteina di interesse. La purificazione della vostra proteina permette che si studino la funzione della proteina e la relativa attività enzimatica. Le informazioni di Stuctural dalla proteina possono anche essere ottenute dalle proteine purificate compreso RMN, le informazioni 3-D quale cristallizzazione della proteina.

Così come uno va circa la purificazione della proteina?

Le proteine possono essere purificate secondo il formato, la solubilità, la carica e l'affinità obbligatoria

Le proteine possono essere visualizzate e differenziate prontamente con i metodi di elettroforesi.  Le tecniche del gel di tesi possono anche essere usate per ottenere le piccole quantità (microgrammi) di polipeptidi purificati.  Tuttavia, non forniscono i grandi importi delle proteine purificate nel loro nativo dichiarano.  Le quantità notevoli di proteine purificate, dell'ordine di molti milligrammi, sono necessarie delucidare completamente la loro struttura tridimensionale ed il loro meccanismo di azione.  Parecchio mille proteine sono state purificate nell'intervento concreto in base a tali caratteristiche come il formato, la solubilità, la carica e l'affinità obbligatoria specifica.  Ad ogni punto nella purificazione, la preparazione si analizza per una proprietà distintiva della proteina di interesse (per esempio attività enzimatica) valutare l'efficacia della procedura.

Le proteine possono essere separate dalle piccole molecole tramite dialisi tramite una membrana semipermeabile, quale la membrana della cellulosa con i pori.  Le molecole che hanno dimensioni significativamente più grandi del diametro del poro sono mantenute trasversalmente all'interno del sacchetto di dialisi, molecole di wwhereas di più piccoli ed ioni i pori di una tal membrana ed emergono nella dialisi fuori del sacchetto.

La separazione più acuta in base al formato può essere realizzata dalla tecnica della cromatografia di gel-filtrazione.  Il campione è applicato alla parte superiore della colonna che consiste dei branelli porosi fatti di un insolubile ma polimero altamente idrato quale dextrano o l'agarosi (che sono carboidrati) o poliacrilammide.  Il Sephadex, il sepharose ed il biogel sono comunemente preparazioni commerciali usate di questi branelli, che sono in genere 100 micrometri di diametro.  Le piccole molecole possono entrare in questi branelli ma quei grandi non possono.  Il risultato è che le piccole molecole sono distribuite sia nella soluzione acquosa all'interno dei branelli che fra loro, mentre le grandi molecole sono situate soltanto nella soluzione fra i branelli.  Le grandi molecole passano più velocemente per questa colonna ed emergono in primo luogo, perché un più piccolo volume è accessibile a loro.  Dovrebbe essere notato che l'ordine dell'emersione delle molecole da una colonna dei branelli porosi è l'inverso dell'ordine nell'elettroforesi del gel, in cui una struttura continua del polimero impedisce il movimento di grandi molecole.  Le quantità di proteina molto più grandi possono essere separate dalla cromatografia di cromatografia d'esclusione che tramite l'elettroforesi del gel ma al prezzo di risoluzione più bassa.

La solubilità della maggior parte delle proteine è abbassata alle alte concentrazioni nel sale.  Questo effetto, chiamato la salatura, è molto utile, benchè non buono capito.  La dipendenza della solubilità su concentrazione nel sale differisce da da una proteina ad un altro.  Quindi la salatura può essere usata per frazionare le proteine.  La salatura è egualmente utile per la concentrazione delle soluzioni diluite delle proteine.

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