Bioinformatics, Protocolli, Proteina Proteomics del RNA del DNA

I Protocolli Domestici Bioinformatic Di Biologia Lavora L'Enciclopedia Che Molecolare Di Biologia Delle Tribune Di Biologia Le Immagini Molecolari Di Biologia Bookmark Noi!

domestico > proteina > proteina-protocolli > occidentale-macchiandosi > index.php

Ricerca Domestica Di Proteomics Della Proteina del RNA del DNA Di Videos Di Scienza Di Notizie Di Scienza Di Biologia Molecolare BETA! Prodotti molecolari di biologia di tecniche molecolari di biologia dell'apparecchiatura del laboratorio di Bioinformatics e collegamenti relativi di biologia di servizi

Biologia Molecolare Blog

Trasmetta questa pagina ad un amico

Stazioni Intracellulari

Circuiti integrati molecolari alfabetici PCR PCR in tempo reale RNAi di Microarray della proteina di Proteomics del peptide di formazione immagine di microbiologia di spettrometria totale di immunologia di Microarrays di istologia di biologia delle cellule del bookstore degli amplificatori comuni degli amplificatori di botanica dell'anticorpo e di elettroforesi del gel della coltura e macchia occidentale di Transfection di biologia della cellula formativa di SiRNA

Macchia Occidentale

 

Protocolli Occidentali Della Macchia

Tribuna Occidentale Della Macchia

Prodotti Occidentali Della Macchia

Libri Occidentali Della Macchia

Macchia Occidentale Che Effettua un analisi guasti

Libri Occidentali Della Macchia

 

Protocollo Macchiantesi Occidentale

Occidentale-macchi il protocollo

Preparazione dei campioni per elettroforesi del gel di SDS-PAGE dalla cellula preparata Lysates

1. Prepari i gel per SDS-PAGE
2. Prepari l'amplificatore corrente del 1X
3. Aggiunga 50 ml di beta-mercaptoetanolo all'amplificatore del campione da 950 ml (per 1 ml). (soltanto se pre-non avete aggiunto il beta-mercaptoetanolo all'amplificatore del campione)
4. Aggiunga l'amplificatore del campione ad ogni campione (predetermini quanto campione potete caricare per il pozzo - i pettini di BioRad possono mantenere sottilmente circa 30uL. I grandi pettini inscatolano il accomate fino a 50uL).
5. Campioni di vortice brevemente.
6. Colpisca un foro in protezione di ogni tubo (per impedire le parti superiori schioccando quando bollono)
7. Boil nel bagno del heating block/water a (95°C) per 5 minuti (le temperature più insufficienti sono state indicate per impedire l'aggregazione della proteina di non-specifico)

Dopo l'ebollizione dei campioni della proteina - caricamento e funzionamento il gel di SDS-PAGE

1. Centrifughi i campioni per 1 minuto all'alta velocità.
2. Carichi il campione in ogni vicolo.
3. Carichi il riferimento di Mw (scaletta del peso molecolare) (potete desiderare
4. Faccia funzionare il gel a 100V (100V through impilando il gel, tensione può essere aumentato fino a 200V quando funziona nella separazione del gel con abbondanza dell'amplificatore corrente)

Trasferimento dei campioni della proteina nella membrana

1. Prepari l'amplificatore di trasferimento del 1X
2. Impregni ed agiti il gel nell'amplificatore di trasferimento per 15 minuti
3. Impregni la membrana della nitrocellulosa (o PVDF) e la carta da filtro (più del normale spessa) per parecchi minuti.
4. Disponga il panino sulla cellula di trasferimento:

RADURA spessa supplementare della carta da filtro
Membrana
Gel
NERO spesso supplementare della carta da filtro

5. Trasferimento elettrico: overnite 35V o 90V per 1 ora secondo il formato della vostra proteina o della vostra pazienza!

Protocollo macchiantesi occidentale o Immunoblotting

1. Prepari il 1X TBST dalle soluzioni di riserva.
2. Prepari ostruire l'amplificatore (albumina del siero di bue di 3% o latte del Macchi-grado di 5% (Blotto) in TBST). (potete desiderare provare varie volte e circostanze ostruenti).
3. Lavi la membrana nel 1X TBST con l'agitazione per 10 minuti.
4. Blocco alla temperatura ambiente per 1 ora con ostruire amplificatore (agitare o rotatore circolare)
5. Incubi la vostra membrana (PVDF o nitrocellulosa) con l'anticorpo primario di 1° ab durante la notte (per macchiarsi difficile condiziona la fosforilazione dello IE delle proteine) o 1 ora per (termini facili quale proteina totale) a 4°C (overnite) o alla temperatura ambiente (un'incubazione di 1 ora soltanto) coperta di involucro di saran (agitazione delicata). Potete utilizzare le vasche di plastica dal deposito del dollaro per questa (usi questi soltanto per macchiarsi!) o parti inferiori del contenitore di pipetta di uso. La diluzione per l'anticorpo primario è intorno 1:1000. Veda le istruzioni del fornitore.
6. Lavisi con 1X TBST  3 x 15 minuti
7. Incubi la vostra membrana (PVDF o nitrocellulosa) con l'anticorpo secondario, 2° ab per 30 – 45 minuti o (1 ora - per le circostanze macchiantesi difficili) alla temperatura ambiente. La diluzione per gli anticorpi secondari è solitamente 1:10,000 o più alto. (IE 1uL di secondario in 10mL di TBST per la membrana) veda le istruzioni del fornitore.  Potete desiderare aggiungere il vostro anticorpo ad ostruire la soluzione a diminuzione non-specifico che si lega particolarmente se otteneste l'alta priorità bassa nel vostro primo esperimento.
8. Lavata con TBST   4-5 x 10 minuti. Ciò è il punto di lavaggio più importante.
9. Ecl (5min)
10. Denunzia alla pellicola. Il tempo di esposizione delle macchie occidentali è solitamente di circa 10-30 secondi. Più lungamente (5-10 minuti) per fosforilazione. Se avete un segnale realmente debole, voi dovete caricare più proteina o la prova per aumentare il tempo di esposizione (fino a 30 minuti - potete provare a lasciarla in un casette più lunga).
11. Mantenga la vostra membrana! Potete mantenere la vostra membrana nel 1X di TBST nel frigorifero per un istante. Potete averli bisogno per i seguenti motivi: 1) controllare caricamento (i critici di carta possono chiedere proteina totale o uno standard di caricamento quale actina). Inoltre, potete sondare inizialmente per una fosfoproteina ed allora mettere a nudo e un reprobe per proteina totale.

Inoltre veda il nostro protocollo mettente a nudo macchiantesi occidentale della membrana